CHO Värdcells-DNA-restdetektionskit (3G)
Kvalifikationssammanfattning (Kat.nr.: 41332ES60)
- Bakgrund
Data som sammanfattas i denna rapport är utförda av Yeasen Biotechnology för CHO Värdcells-DNA Residue Detection Kit (3G) produkt. Sammanfattningsdata är endast för användarens referens, och användaren måste verifiera värdcellsresten DNA-metoden genom att använda sina egna prover för att bekräfta att metoden kan uppfylla användarens krav. Alla laboratorier som använder detta kit rekommenderas att verifiera följande parametrar: Linjäritet, Område, Noggrannhet, Precision, Kvantifieringsgräns, Specificitet och Robusthet.
Yeasen Biotechnology kan tillhandahålla den detaljerade kvalificeringsrapporten för detta kit. Om användaren använder den här rapporten är det bara lämpligheten (som inkluderade Precision, Noggrannhet och specificitet) bör verifieras.
- Experimentella material och metoder
2.1 CHO Värdcells-DNA Residue Detection Kit (3G), leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 41332ES60.
2.2 MolPure Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, Leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 18461ES60.
2.3 Originaldata: den elektroniska versionen registrerades i "Experimentrapporten" underfilen till den överordnade filen CHO Värdcells-DNA-restdetektionskit (3G).
2.4 Metoder: Materialen och operationsmetoderna som användes för experimentet har i princip producerats eller satts av Yeasen Biotechnology, vilka utvärderades och verifierades under lång tid, utvecklingen och tillverkningen av satsen följs ISO 13485-systemet.
- Kvalifikationens innehåll och resultat
3.1 Detektionsområde
Det linjära området för kitet var 3 fg/μL~300 pg/μL med R2=1, och amplifieringseffektiviteten var 99,09% med CV <15% för varje koncentrationsanalys.
Figur 1 CHO DNA (3G) qPCR standardkurva
3.2 Noggrannhet
3.2.1 Råterhämtning
3.2.1.1 Experiment för återhämtning av tomprovsspik
Prover av CHO DNA-standarder vid höga och låga koncentrationer: 30 pg/μL, 300 fg/μL respektive 3 fg/μL preparerades och analyserades efter extraktion med hjälp av magnetpärlmetoden för resterande DNA-prov förbehandlingskit (3 extraktionsreplikat utfördes för varje prov, och 3 analysreplikat gjordes för varje extraktion), och provåtervinningen och CV:n analyserades.
För olika koncentrationer av DNA-prov varierade återvinningarna från 70 % till 130 %, och CV:n var alla <20 %.
| Provtyp | Teoretisk koncentration | Extrahera 1 medelvärde | Extrahera 2 medelvärde | Extrahera 3 medelvärde | Genomsnittlig koncentration | CV | Återhämtning |
| Tomt prov | / | / | / |
| / | / | / |
| Återvinningsprov 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27,51 | 28.27 | 27,62 | 2,20 % | 92,06 % |
| Återvinningsprov 2 | 300 fg/μL | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294,16 | 2,71 % | 98,05 % |
| Återvinningsprov 3 | 3 fg/μL | 3,50 | 3,54 | 3,31 | 3,45 | 3,56 % | 115,00 % |
Tabell 1 Återställning av tomprovsspik
3.2.1.2 Simulerat provspikåterställningsexperiment
Prover av samma koncentration (300 fg/μL CHO-DNA) extraherades (3 extraktionsreplikat utfördes för varje prov och 3 analysreplikat gjordes för varje extraktion) med 5 olika bakgrundslösningar (högt protein, hög nukleinsyra, högt och lågt pH, högt salt) och provåtervinning och CV analyserades.
DNA-prover för olika bakgrundslösningar varierade från 70 % till 130 %, med alla CV:n <20 %.
| Provtyp | Teoretisk koncentration | Extrahera 1 medelvärde | Extrahera 2 medelvärde | Extrahera 3 medelvärde | Genomsnittlig koncentration | CV | Återhämtning |
| Grundprov | / | / | / |
| / | / | / |
| Högt protein | 300 fg/μL | 302,29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47 % | 108,66 % |
| Hög kärnsyra | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28 % | 98,21 % | |
| Högsalt | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00 % | 96.90 % | |
| Högt pH | 296,04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92 % | 104,57 % | |
| Lågt pH | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89 % | 109,21 % |
Tabell 2 Grundläggande prov återhämtning av spik
3.3 Precision
3.3.1 Repeterbarhet
Upprepa analysen 10 gånger för CHO DNA-standarder vid en koncentration av 3 fg/μL med en CV <15%.
| Upprepningar | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Betyda | CV % |
| Detektionsvärde (fg/μL) | 3.13 | 3,26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2,87 | 2,88 | 2,75 | 2,87 | 3.15 | 2,99 | 5,65 % |
Tabell 3 Upprepningsresultat
3.3.2 Mellanprecision
Tre experimentörer testade oberoende CHO DNA-standardprover vid höga och låga koncentrationer: 300 pg/μL, 3 pg/μL och 3 fg/μL, och tre replikat gjordes för varje koncentration, och CV:n för alla nio erhållna data var <15%.
| Exp |
Faktisk koncentration Teoretisk koncentration | CHO DNA (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/ul | 3 fg/uL | ||
| Exp 1 | Beslutsamhet 1 | 302,63 | 2,97 | 3,40 |
| Beslutsamhet 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Beslutsamhet 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Beslutsamhet 4 | 292,27 | 2,92 | 3.47 |
| Beslutsamhet 5 | 299,61 | 2,90 | 2,82 | |
| Beslutsamhet 6 | 305,73 | 2,93 | 2,90 | |
| Exp 3 | Beslutsamhet 7 | 301,06 | 3.17 | 3.15 |
| Beslutsamhet 8 | 299,17 | 3.00 | 3.21 | |
| Beslutsamhet 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Betyda | 297,04 | 2,98 | 3.13 |
| / | CV % | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Tabell 4 Resultat med medelprecision
3.4 Specificitet
Interferensen av cellulärt genomiskt DNA som vanligtvis används i produktionen av biologiska läkemedel bedömdes för interferens med CHO DNA-detektionsreagens, och interferensgruppen överlappade kontrollgruppen och ingen interferens sågs (figuren nedan visar, i ordning, interferensdata från Mouse, MDCK, HEK293 och E.coli genomiska DNA med CHO DNA-detektionsreagens).
Figur 2 Interferensexperimentresultat
3.5 Kvantifieringsgräns
CHO-DNA detekterades vid 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3fg/ul och 0,1 fg/μL, med 10 replikat för varje koncentration. Resultaten visade att CV var <20 % vid koncentrationer på 0,3 fg/μL och över. Det vill säga gränsen för kvantifiering av CHO-värdcells-DNA-resterdetektionskit (3G) var 0,3 fg/μL.
|
Upprepningar Testobjekt | CHO DNA (3G) (fg/μL) | |
| Kvantitet | Omräkningskvot % | |
| 1 | 0,28 | 93,33 % |
| 2 | 0,26 | 86,67 % |
| 3 | 0,32 | 106,67 % |
| 4 | 0,30 | 100,00 % |
| 5 | 0,33 | 110,00 % |
| 6 | 0,23 | 76,67 % |
| 7 | 0,29 | 96,67 % |
| 8 | 0,37 | 123,33 % |
| 9 | 0,31 | 103.33 % |
| 10 | 0,28 | 93,33 % |
| Betyda | 0,30 | / |
| CV % | 13,09 % | / |
Figur 3. CHO DNA (3G) qPCR-testresultat
3.6 Detektionsgräns
CHO-DNA detekterades vid 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL och 0,01 fg/μL, med 20 replikat för varje koncentration. Resultaten visade att detektionshastigheten var ≥19 (dvs. detektionshastighet ≥95%) i 20 replikatbrunnar vid koncentrationer på 0,05 fg/μL och däröver. Det vill säga detektionsgränsen för CHO-värdcells-DNA-resterdetektionskit (3G) var 0,05 fg/μL.
Figur 4. CHO DNA (3G) qPCR-testresultat
3.7 Robusthet
Detta kit har testats och är lämpligt för, men inte begränsat till, följande instrument:
| Försäljare | Instrumentmodeller | Amplifieringseffektivitet | R2 | Kvantifieringsgräns | CV | Detektionsgräns | Detektionshastighet |
| Termo | ABI 7500 | 99,69 % | 1 | 0,3 fg/μL | 12,40 % | 0,05 fg/μL | 95,65 % |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 99,26 % | 1 | 0,3 fg/μL | 15,30 % | 0,05 fg/μL | 100,00 % |
| Roche | LightCycler480 | 2,05 % | 0,978 | 0,3 fg/μL | / | 0,05 fg/μL | / |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,14 % | 0,999 | 0,3 fg/μL | 14,41 % | 0,05 fg/μL | 95,65 % |
Tabell 5 Testresultat för instrumentets lämplighet
3.8 Stabilitet
3.8.1 Frys-tina stabilitet
CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) testades genom upprepad frysning och upptining 10 gånger, och satsens prestanda påverkades inte.
|
Testindikatorer Frys-tina tider | Parameter | T0 tid | Frys-tina 10 gånger |
| Standardkurvaparameter | Amplifieringseffektivitet | 95,70 % | 98,62 % |
| R2 | 1 | 1 | |
| Kvantifieringsgräns (0,3 fg/μL) | CV | 15,31 % | 17,16 % |
| Detektionsgräns (0,05 fg/μL) | Detektionshastighet | 95,65 % | 100 % |
Tabell 6 Analys av frys-upptining stabilitetsresultat
3.7.2 Accelererad stabilitet
CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) förvarades vid 2~8°C i 30 dagar respektive 37°C i 14 dagar. Ingen av satsens prestanda påverkades.
|
Testindikatorer Accelerationstemperatur och tid | Parameter | Experiment 1 | Experiment 2 | ||
| T0 tid | 2~8℃ 30 dagar | T0 tid | 37℃ 14 dagar | ||
| Standardkurvaparameter | Amplifieringseffektivitet | 100,53 % | 102,61 % | 101,76 % | 101,84 % |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Kvantifieringsgräns (0,3 fg/μL) | CV | 17,16 % | 12,63 % | 16,27 % | 12.49 |
| Detektionsgräns (0,05 fg/μL) | Detektionshastighet | 95,65 % | 100 % | 95,57 % | 100 % |
Tabell 7 Accelererad stabilitetsresultatanalys
3.9 Gräns för tomt
3.9.1 Ingen mallkontroll (NTC)
Ingen mallkontroll (NTC) var DNA-spädningen med 96 repetitioner för att göra qPCR kvantitativ analys, alla CT-värden över de 96 testade replikatbrunnarna var >40.
Figur 5 NTC-experimentresultat
3.9.2 Negativt extraktionskontrollprov (NCS)
Negativt extraktionskontrollprov (NCS) var DNA-spädningen, och det extraherades först genom provförbehandling, sedan gjordes qPCR, alla CT-värden över de 48 testade replikatbrunnarna var >40.
Bild 6 NCS experimentresultat
- 4.Hänvisning
4.1 Chinese Pharmacopoeia Commission (ChPC). Farmakopén för Folkrepubliken Kina (Vol Ⅲ) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, s. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Allmänna principer för teknisk granskning av analytisk metodvalidering för kvalitetskontroll av biologiska produkter.
4.3 ICH(2022)《Analytisk metodvalidering Q2》, utkastversion.
Beställningsinformation
| Beskrivning | Artikelnummer |
| 41332ES | |
| 41331ES | |
| 41307ES | |
| 41308ES | |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR Detection Kit (2G) | 40619ES |