I takt med att medicinsk forskning fortsätter att utvecklas har riktad terapi blivit mer mogen. Utgångspunkten för riktad behandling är att göra genetiska tester på läkemedels molekylära mål för att identifiera genmutationer som orsakar ärftliga störningar eller maligniteter. ARMS-PCR är en ny metod baserad på PCR som kan detektera många DNA-punktmutationer. För närvarande är det en av de mest väsentliga och utbredda metoderna för skräddarsydd genetisk identifiering av cancer. Fördelarna med dess terapeutiska användning har väl erkänts av fältexperter.

1. Hur fungerar allelspecifik PCR?
2. Hur förbättrar man ARMS specificitet?
3. Vilka egenskaper har produkter från Yeasen?
4. Vad är produktprestandadata?
5. Hur beställer folk produkter?

1. Hur fungerar allelspecifik PCR?

ARMS-PCR är Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), även känd som Allele-Specific PCR (AS-PCR). Den allelspecifika förlängningen regleras för att identifiera vildtypsallelen och den muterade vildtypsgenen, och fluorescenssignalvärdet mäts med hjälp av Taqman-probtekniken.
ARMS PCR-primrar är designade med olika nukleotider vid 3'-änden av de två uppströmsprimrarna av allelen, och de två primrarna är specifika för vildtypen respektive mutanttypen. Under amplifiering kan uppströmsprimrar som inte helt matchar mallen inte bilda komplementära baspar, vilket resulterar i felparningar, hindrad förlängning och oförmåga att generera PCR-produkter, medan primersystem som matchar mallen kan amplifiera motsvarande PCR-produkter. Fluoroforen på Taqman-proben kan avge en fluorescerande signal som kan detekteras av enheten, och genotypen kan valideras genom att utvärdera fluorescensdata.
ARMS-teknologin har hög känslighet, detektionsgränsen kan nå 100 kopior/ml, och detektionsgränsen för tumörvävnad kan nå en mutationshastighet på 0,5 %. Dessutom är ARMS tidskrävande och låg kostnad, och resultaten är intuitiva och lätta att bedöma. Detta beror på att ARMS kombinerat med qPCR eller elektroforesteknologi endast kräver en PCR-reaktion, vilket tar kortare tid. Endast uppströmsprimrar behöver optimeras för ARMS-teknik, som har lägre kostnad och intuitiva resultat jämfört med realtids-PCR-teknik som använder MGB-sonder. Eftersom det mesta av DNA som extraherats från paraffininbäddade vävnadsprover är fragmenterat, kan exakta detektionsresultat inte erhållas. ARMS-metoden är utformad för att minimera längden på målprodukten och därigenom åtgärda denna svårighet i paraffininbäddad vävnad. Samtidigt realiserar ARMS kombinerat med PCR-plattformen drift med slutna rör, som är enkel att använda och inte kräver efterbearbetning av produkten, och undviker därmed kontaminering av amplifieringsprodukter i största utsträckning.
Teoretiskt sett måste Taq DNA-polymeras vara helt komplementärt till den återstående mallen vid 3'-änden av primern för att utföra effektiv polymerisation. Men stringensen av Taq DNA påverkas av flera faktorer. I vissa fall kan en förlängning fortsätta även om primerns 3'-terminala bas inte är komplementär till mallen. Om det bara finns en basfelmatchning vid 3'-änden kan primrarna vara felaktiga och förlängas, men förlängningseffektiviteten är låg. Olika 3'-änddislokationer har olika förlängningseffektivitet. Om andra felaktiga baser introduceras vid 3'-änden är antalet felmatchningar för stort, och 3'-änden kan inte förlängas efter en viss nivå.Därför kan endast en basfelmatchning vid 3'-änden av primern inte adekvat särskilja de två allelerna, vilket resulterar i falskt positiva resultat.

2. Hur förbättrar man ARMS specificitet?

Fokus för att förbättra ARMS-specificiteten är att förbättra primerförlängningsspecificiteten. En felaktig bas kan införas vid 2:a eller 3:e basen från 3'-änden. De felmatchade baserna verkar tillsammans med de felmatchade baserna vid 3'-änden, och i mallen som inte är komplementär till 3'-änden reduceras primeramplifieringsprodukthastigheten. Medan primrar amplifierar normalt i mallar som är komplementära till deras 3'-ändar, beror typen av felmatchade baser av primrar på typen av basfelmatchning vid 3'-änden.
Efter att de specifika primrarna för ARMS har utformats krävs ett par TaqMan-sonder för allelspecifik fluorescensresonansenergiöverföring. TaqMan-sonder har två fluorescerande färgämnen, 5'-änden är en fluorescerande gen och 3'-änden har en allmän fluorescenssläckande gen. I en komplett sond är quenchergenen och den fluorogena genen rumsligt mycket nära varandra, vilket resulterar i fluorescenssläckning. Under normala förhållanden kan fluorescensen som emitteras av fluoroforen vid 5'-änden inte detekteras, och endast bakgrundsfluorescensen hos utsläckaren vid 3'-änden kan detekteras. I processen för målgenamplifiering kommer både PCR-primrar och fluorescensmärkta prober att vara komplementära till målsekvensen under de-OR. När Taq-enzymet möter en sond stabilt bunden till mallen när mallsträngen förlängs, kommer 5'-3'-exonukleaset av Taq-enzymet att bryta ned den specifika proben som är bunden till mallen. Fluoroforen på sonden separeras av fysiskt utrymme, släckningseffekten försvinner och fluorescens emitteras. Felmatchningar mellan svagt fluorescerande prober och målsekvenser kommer att minska mängden frisatt fluorescens.

Figur 1 Grundläggande koncept för ARMS-PCR

3. Vilka egenskaper har produkter från Yeasen?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix är ett kit baserat på amplifieringsblockkonceptet som möjliggör effektiv ARMS-PCR-medierad genotypning.

👍Hög selektivitet: kan identifiera flera genmutationer;
👍Hög känslighet: mutantprimrar kan detektera mutationer vid koncentrationer så låga som 0,5 % i 10 ng/L DNA;
👍Enkel att läsa: Resultaten är uppenbara och objektivt bedömd, och det är okomplicerad och okomplicerad;
👍Enkel att använda: Den är kompatibel med en rad PCR-utrustning, driftsättet är standardiserat och omborddetektionen kan utföras på 90 minuter.

4. Vad är produktprestandadata?

4.1 Överlägsen produktblockeringseffekt

Experiment: 5L mallinmatning, 10ng/L vildtypsmall och ekvivalenta mängder mutantplasmid amplifierades med användning av mutantprimrar
Webbplats: KRASG13D（38G>A）
Röd：13755；Blå: Konkurrenter

Figur 2 visar att vildtypsprimrar amplifierar både vildtyps- och mutantmallar. Enligt amplifieringskurvan har vildtypsmallen ingen topp eller skillnaden i Ct-värde mellan vildtypen och mutanten är 6-8, vilket gör att vildtyps- och mutantgenerna effektivt kan särskiljas.

4.2 Produktdetekteringshastigheten kan nå 0,05 %

Experiment 1: Självblandande standardberedningsteknik (50%): 50μL 10ng/μL vildtyps-DNA och 50μL 3X103 kopior av mutantplasmid.
Webbplats: KRASG13D(38G>A)

Figur 3. Enligt amplifieringskurvan fortsätter produkten att fungera effektivt vid en koncentration av 0,05 %

Experiment 2: Den köpta 5 %-standarden (50 ng/μL) späddes med biblioteksspädningsmedel till 10 ng/μL, späddes sedan ytterligare med 10 ng/μL 293 g DNA till 0,1 % och 0,05 %.
Webbplats: L858R
Röd：13755；Blå: Konkurrenter

Figur 4: Enligt amplifieringskurvan kan detektionshastigheten för loci mot en vildtyp gDNA-bakgrund på 10ng/μL vara så hög som 0,05 %, och efterföljande validering enligt kommersiella standarder visar att våra produkter har en utmärkt detektionshastighet.

4.3 Utmärkt produktstabilitet

Produktens förstärknings- och blockeringseffekt påverkas inte av 10 cykler av frysning och upptining.
Experiment: röd: -20 ℃; grön: äkta frys-tina 5 gånger; blå: äkta frys-tina 8 gånger; lila: äkta frys-tina 10 gånger.
Webbplats: L858R

Figur 5 visar att upprepad frysning och upptining av reagens 13755 tio gånger inte har någon inverkan på dess amplifierings- och blockeringsegenskaper.

Dess amplifierings- och blockeringseffekter påverkas inte av 37 °C i 7 dagar.
Experiment: Röd: -20°C; Grön & lila: 37°C i 7 dagar.
Webbplats: L858R

Figur 6 visar att sju dagar vid 37°C inte har någon inverkan på amplifierings- och blockeringsverkan av 13755-reagens.

5. Hur beställer folk produkter?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., grundat 2014, är ett högteknologiskt företag som är engagerat i FoU och produktion av verktygsenzymråmaterial och antigenantikroppar. Dess produkter inkluderar molekylära diagnostiska enzymer, proteiner och antikroppar som används i läkemedel, livsmedelssäkerhetstestning, avel, rättvisa och andra industrier. Vi har åtagit oss att förse kunder inom biovetenskap med högkvalitativa produkter och tjänster. Produkterna som Yeasen kan tillhandahålla är följande:

Tabell 1: Produkter från Yeasen