dNTP står för mönstrat ribonukleotidtrifosfat som används i PCR, som kan amplifiera en växande DNA-sträng. Med andra ord, dNTPs i PCR-hem med komplementära DNA-strängar genom vätebindningar, och de växande DNA-strängarna expanderas med hjälp av Taq DNA-polymeras. Vad är den specifika tillämpningen av dNTP i PCR? Vilka egenskaper behöver dNTP:er med hög renhet ha?

1. Vad är dNTP?
2. Vad är koncentrationen av dNTP i PCR?
3. Vilka egenskaper krävs för High purity dNTP?
4. Relaterade produkter och prestanda

1. Vad är dNTP?

Deoxinukleosidtrifosfater (dNTP) är nukleosidtrifosfater som innehåller deoxiribos, en kedja av nukleotider som består av ribos, en bas och ett fosfat. dNTP: er är de väsentliga byggstenarna i nukleinsyramolekyler och är som sådana nödvändiga komponenter i PCR-blandningar eftersom inget nytt amplifierat DNA skulle kunna genereras utan dem. De fyra individuella deoxinukleotiderna som utgör en DNA-sekvens inklusive deoxyadenosintrifosfat (dATP), deoxytymidintrifosfat (dTTP), deoxycytidintrifosfat (dCTP) och deoxyguanosintrifosfat (dGTP). Dessutom är kvaliteten på dNTP:er också avgörande för framgången för många procedurer såsom PCR, cDNA-syntes, qPCR, sekvensering, kloning och DNA-märkning.

Det finns fyra typer av dNTP, eller deoxinukleotidtrifosfat, där var och en använder olika DNA-bas: adenin (dATP), cytosin (dCTP), guanin (dGTP) och tymin (dTTP). Att använda dNTP under förlängningsfasen ger enkla baser redo att gå in i DNA och fördubbla det, som byggstenar. Eftersom syftet med tekniken är att syntetisera nytt DNA, tillhandahåller dNTP nukleotider till den "upplåsta" strängen med hjälp av mallen på en enda sida. Detta förvandlar en enkel DNA-sträng till två och kan fortsätta exponentiellt så länge som reagenser förblir närvarande tills det sista hållstadiet.

2. Vad är koncentrationen av dNTP i PCR?

PCR är en in vitro-teknik för DNA-syntes som utförs för att generera flera kopior av ett DNA-fragment av intresse så att det kan visualiseras under gelelektrofores. Syftet med PCR är att göra ett stort antal kopior av DNA för olika nedströmsapplikationer inom DNA-sekvensering eller DNA-mikroarrayer. Dess komponenter inkluderar DNA-mallar, primrar, buffertar och Taq DNA-polymeras dNTP. För att förstå mekanismen för PCR är det nödvändigt att förstå vikten och principen för de komponenter som används. dNTP är en av nyckelkomponenterna i PCR. Funktionen av dNTPs i PCR är att amplifiera den växande DNA-strängen med hjälp av Taq DNA-polymeras och att kombinera med den komplementära DNA-strängen genom vätebindning.

Processen för PCR är uppdelad i tre temperaturberoende steg: denaturering, hybridisering och förlängning. Under denatureringssteget denatureras dubbelsträngat DNA till enkelsträngat DNA. Under hybridiseringssteget binder primrarna vid den exakta platsen för deras komplementära sekvens, och under förlängningssteget lägger Taq DNA-polymeras till dNTP till den växande DNA-strängen. När strängarna har öppnats och primrarna binder till det enkelsträngade DNA:t börjar Taq DNA-polymeras sin katalytiska aktivitet. I nästa steg startar tillägget av dNTP, som binder till P-DNA-komplexet med mindre affinitet om den exakta komplementära nukleotiden är närvarande. Strax efter att Taq DNA-polymeras håller i sig uppstår vätebindningsinteraktioner mellan komplementära baser och dNTP. Här är det inte hela nukleotiden i början, utan basen (kvävebasen) på dNTP som avgör om man ska binda eller inte.För det första, om den hittar en komplementär bas (A för T, G för C) på mallen ssDNA, kommer den att bilda en vätebindning mellan dem. Tre vätebindningar mellan C och G och två vätebindningar mellan A och T skapas. När väl vätebindningen har bildats följer Taq DNA-polymeras inkorporeringen av dNTP i den växande DNA-strängen genom att bilda en fosfodiesterbindning. Nu efter att fosfodiesterbindningen har bildats går Taq DNA-polymeras ett steg längre i att lägga till nya dNTP:er. En fosfodiesterbindning bildas mellan 3'OH i primern och 5'P i dNTP. Efter vätebindning katalyserar Taq DNA-polymeras reaktionen genom att ta bort gamma- och beta-fosfater från trifosfaterna i dNTP:er. Efter att reaktionen är avslutad frigörs två pyrofosfater (PPi). Men den exakta kinetiken för dNTPs och Taq-polymerasinteraktion i PCR-reaktioner är fortfarande okänd.

Dessa fyra nukleotider tillsätts vanligtvis till PCR-reaktionen i ekvimolära mängder för optimal basinkorporering. I vissa situationer, såsom slumpmässig mutagenes genom PCR, tillförs emellertid obalanserade dNTP-koncentrationer avsiktligt för att främja en högre grad av felinkorporering av ett icke-korrekturläsande DNA-polymeras. Faktorn som bestämmer den lägsta dNTP-koncentrationen är DNA-längden och sammansättningen av målsekvensen. I PCR-reaktionen är dNTP i allmänhet 50-200 μmol/L. När den slutliga dNTP-koncentrationen är större än 50 mmol/L kan det hämma aktiviteten av Taq DNA-polymeras. Koncentrationerna av de fyra dNTP bör vara lika för att minska felinkorporering under amplifiering på grund av brist på en dNTP.

I vanliga PCR-tillämpningar är den rekommenderade slutliga koncentrationen av varje dNTP vanligtvis 0,2 mM. Högre koncentrationer kan vara till hjälp i vissa fall, särskilt i närvaro av höga koncentrationer av Mg²⁺, som Mg²⁺ binder till dNTP och minskar deras inkorporeringshastighet, vilket ökar den icke-specifika hastigheten. dNTP innehåller fosfat, som kan kombineras med Mg²⁺ för att minska koncentrationen av fritt Mg²⁺, så förändringen i dess koncentration kommer att påverka den effektiva koncentrationen av Mg²⁺. Under högkoncentrations-DNA- och dNTP-förhållanden kan Mg²⁺ koncentrationen bör justeras därefter. Dessutom leder bristen på dNTP till ofullständiga PCR-produkter. Däremot kan dNTP som överskrider optimala koncentrationer hämma PCR. För effektiv inkorporering av DNA-polymeras bör fria dNTPs vara närvarande i reaktionen i en koncentration av inte mindre än 0,01-0,015 mM.

3. Vilka egenskaper krävs för High purity dNTP?

Sedan upptäckten är polymeraskedjereaktionen det oöverträffade verktyget som används i molekylär genetisk forskning. dNTP används i PCR för att expandera den växande DNA-strängen. Även om kvaliteten på dNTP i systemet är dålig kommer det att ha en negativ inverkan på slutproduktens egenskaper. Yeasens High purity dNTP är lämplig för alla typer av mycket känsliga och reproducerbara DNA-syntesapplikationer.

Yeasen erbjuder färdiga att använda nukleotider, set och blandningar av GMP-grad, levererade som natriumsalter i renat vatten vid pH 7,0. Tillverkningsprocessen eliminerar föroreningar och PCR-specifika hämmare, och dNTP:erna är speciellt tillverkade för molekylärbiologiska tillämpningar. dNTP:erna renas med preparativ HPLC och har minst 99% renhet. De kan användas i PCR, RT-qPCR, LAMP, DNA-märkning och DNA-sekvenseringsprocesser.
Rigorösa kontrollstandarder och den senaste tekniken säkerställer den bästa kvaliteten på produkten. Varje parti av dNTP testas för olika rester (bakteriellt DNA, humant DNA, DNas, RNas, endonukleas).Produkten är stabil från batch till batch och lämplig för alla typer av mycket känsliga och reproducerbara DNA-syntesapplikationer.

4. Relaterade produkter och prestanda

4.1 Ingen bakteriell DNA-rester

Figur 1. Detektionsresultaten visar att dNTP:erna inte har några bakteriegenomrester.

4.2 Inga mänskliga DNA-rester

Figur 2. Detektionsresultaten visar att dNTP inte har några humana genomrester.

4.3 Ingen DNas-, RNas- och endonukleaskontamination

Figur 3. Detektionsresultaten visar att dNTP inte har något DNas, RNas och endonukleas.

4.4 PCR-amplifiering (20 kb DNA)

Figur 4. PCR-amplifieringsresultatet är den förväntade 20 kb-produkten.

4.5 Produktinformation

Produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande.

Tabell 1.Produktinformation