Sedan mars 2022 bröt den listiga mutantstammen Omicron återigen människors fredliga liv, de nya coronavirusepidemierna bröt ut över hela landet och drabbade 30 provinser (autonoma regioner och kommuner). Som ett effektivt medel för exakt förebyggande och kontroll av SARS-CoV-2-epidemin har nukleinsyradetektering blivit ett normalt sätt att leva. "Gjorde du nukleinsyratestet idag?" Det har också blivit en daglig hälsning av människor. På tal om det, vet du vilka kärnråvaror som behövs för att detektera nukleinsyra? Denna artikel kommer att introducera det kritiska kärnråmaterialet i nukleinsyradetektionsenzym.

1. Nukleinsyradetekteringsprocess för SARS-CoV-2

2. Kärnanzymer i nukleinsyraextraktion

3. Kärnanzymer under RT-qPCR

4. Kärnenzymer av SARS-CoV-2 nukleinsyradetektering från Yeasen

1. Nukleinsyradetekteringsprocess för SARS-CoV-2

Ett enzym är en extremt viktig klass av biokatalysatorer med hög katalytisk effektivitet och reaktionsspecificitet. De flesta biokemiska reaktioner kräver deltagande av enzymer. I processen för nukleinsyradetektering av 2019-nCoV (visas i figur 1) spelar olika typer av molekylära enzymer en viktig roll i olika experimentella stadier som nukleinsyraextraktion och RT-qPCR. Därefter, enligt de olika experimentella länkarna i nukleinsyradetektion, kommer vi att sortera ut kärnenzymråmaterialen som används i nukleinsyradetektionsprocessen.

Figur 1. Nukleinsyradetekteringsprocess för SARS-CoV-2

2. Kärnanzymer i nukleinsyraextraktion

Den nya processen för nukleinsyraextraktion av coronavirus inkluderar huvudsakligen två steg: lysering och rening. Lysis är processen att förstöra cellstrukturen i provet så att nukleinsyran i provet är fri i lyssystemet; Rening är den fullständiga separationen av nukleinsyra från andra komponenter i lyssystemet, såsom protein, salt och andra föroreningar, och reaktionsprocessen kräver deltagande av proteinas K, deoxiribonukleas I och RNas-hämmare.

2.1 Proteas K

Proteinas K är ett serinproteas med bred klyvningsaktivitet, klyvningsställena är de karboxiterminala peptidbindningarna av alifatiska och aromatiska aminosyror (Figur 2). I processen för nukleinsyraextraktion kan proteinas K bryta ned histoner som är tätt bundna med nukleinsyror, främja separationen av nukleinsyror och göra provnukleinsyran lättare att extrahera. Dessutom kan proteinas K bryta ned RNA-hydrolas (RNas)-aktivitet och hämma RNas-hydrolys av mall-RNA.

Figur 2. Schematiskt diagram av proteinas K-hydrolyserande peptidbindningar

Yeasen Biotech Proteinas K (Cat#10401ES) härrör från rekombinant jäststam, specifik aktivitet ≥30 U/mg, fri från RNas och DNas, och stabil enzymaktivitet i urea och SDS-lösning. Det är aktivt i ett brett pH-område (pH 4,0~12,0), lämpligt för klyvning och avlägsnande av proteiner såsom in situ hybridiseringsprovberedning och nukleinsyrarening.

2.2 Deoxiribonukleas I

Deoxiribonukleas I (DNas I) kan katalysera olika former av DNA, inrikta sig på klyvning av fosfodiesterbindningar intill pyrimidiner, och generera polynukleotider med en fosfatgrupp i 5'-änden och en hydroxylgrupp i 3'-änden, den genomsnittliga digestionsprodukten är den minsta polyten av nukleotid.I processen med SARS-CoV-2-nukleinsyraextraktion används DNas I huvudsakligen för att avlägsna genomisk kontaminering i RNA-prover, undvika DNA-rester i RNA-mallar och förbättra renheten hos mallar.

Yeasen Biotech DNas I (Cat#10325ES) härrör från rekombinanta E. coli-stammar, RNas-fria och kan användas för behandling av olika RNA-prover. det optimala arbets-pH-intervallet är 7,0-8,0. I närvaro av Mg2+ kan DNas I klyva vilket ställe som helst av dubbelsträngat DNA slumpmässigt; medan i närvaro av Mn²⁺DNas I kan klyva DNA dubbelsträngat på samma ställe och bilda trubbiga ändar eller 1-2 nukleotider överhängande klibbiga ändar (visas i figur 3).

Fig. 3. Schematiskt diagram av DNas I-klyvande dsDNA i närvaro av Mg²⁺ och Mn²⁺

2.3 RNas-hämmare

I processen för detektion av SARS-CoV-2-nukleinsyra kan extraktion och rening av provnukleinsyra eller beredningen av det experimentella reaktionssystemet introducera ribonukleas (RNas)-kontamination, vilket resulterar i nedbrytning av RNA-mallen. För att undvika RNas-kontamination krävs RNas-hämmare.

RNas-hämmare är en specifik RNas-hämmare i human placenta, som specifikt kan binda RNas för att bilda ett komplex med en icke-kovalent bindning och inaktivera RNas. Yeasen Biotech Murin RNas-inhibitor (Cat#10603ES) innehåller inte två cysteiner som är mycket känsliga för oxidation i mänskliga proteiner. Det har högre antioxidantaktivitet och kan i stor utsträckning hämma olika typer av RNaser (RNas A, B, C), mer lämpade för experiment som är känsliga för hög ditiotreitol (DTT) såsom qPCR.

3. Kärnanzymer under RT-qPCR

Efter att nukleinsyraextraktionen av SARS-CoV-2-provet är klar kan nukleinsyradetekteringen slutföras med RT-qPCR. I processen för dessa experiment är DNA-polymeras, omvänt transkriptas och uracil-DNA-glykosylas alla viktiga kärnenzymråvaror.

3.1 Omvänt transkriptas

Efter extraktion och rening behöver SARS-CoV-2-RNA omvänt transkriptas för att katalysera dNTP-polymerisation för att generera en cDNA-sekvens som är komplementär till mall-RNA:t (Figur 4). För RT-qPCR-reaktion bör högtemperaturresistent omvänt transkriptas väljas. För närvarande är MMLV omvänt transkriptas det mest använda, på grund av dess brist på DNA-endonukleasaktivitet och låg RNas H-aktivitet har det fler fördelar vid tillämpningen av cDNA-kloning.

Figur 4. Schematiskt diagram av den omvända transkriptionsprocessen

Yeasen Biotech Hifair™ V Omvänt transkriptas (Cat#11300ES) är ett nytt omvänt transkriptas erhållet med genteknik. Den har god termisk stabilitet och tål reaktionstemperaturer upp till 60°C. Och det är det också lämplig för omvänd transkription av RNA-mallar med komplexa sekundära strukturer. Samtidigt förstärker enzymet affiniteten med mallen, är lämpligt för omvänd transkription av ett litet antal mallar och gener med låg kopia, och kan amplifiera cDNA upp till 10 kb.

3.2 DNA-polymeras

Efter att mallomvänd transkriptionsprocessen har slutförts för att generera dubbelsträngat cDNA, krävs "själaspelar"-DNA-polymeraset i PCR-reaktionen för att göra ett framträdande, genom att polymerisera fria deoxiribonukleotider för att förlänga DNA-kedjan, och en stor mängd mall-DNA amplifieras in vitro för att uppnå syftet med viral nukleinsyradetektion.

Det DNA-polymeras som vanligtvis används i RT-qPCR-reaktioner är Taq DNA-polymeras med varmstart. Denna typ av enzym är inaktivt vid rumstemperatur.Den har polymerisationsaktivitet först efter varmstart, vilket kan minimera genereringen av bakgrundssignaler. Det löser problemen med ospecifik amplifiering orsakad av generering av primer-dimer eller felparning i konventionella PCR-reaktioner. För närvarande inkluderar de vanligen använda metoderna för varmstartsmodifiering av DNA-polymeras huvudsakligen kemisk modifiering, ligandmodifiering och antikroppsmodifiering. Principerna för olika hot-start modifieringsmetoder visas i figur 5.

Figur 5. Schematiskt diagram över olika typer av modifierade varmstartsenzymer

Yeasen Biotech UNICONTM Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL (Cat#10726ES) är ett dubbelblockerande hot-start DNA-polymeras med hög mallaffinitet. Vid rumstemperatur, inte bara 5'→3' polymerasaktiviteten blockeras, men även 5'→3' exonukleasaktivitet blockeras. Denaturering vid 95°C under 30 sekunder kan helt inaktivera den blockerande antikroppen, frigöra DNA-polymerasaktivitet och exonukleasaktivitet. Den dubbelblockerande funktionen kan inte bara effektivt förhindra ospecifik amplifiering orsakad av felparningar eller primerdimerer, utan också effektivt hämma minskningen av fluorescenssignalen orsakad av sondnedbrytning. Den dubbla garantin gör in vitro-detektionsreagenserna mer stabila under transport eller användning vid rumstemperatur.

3.3 Uracil-DNA-glykosylas

I processen med att detektera nya coronavirusnukleinsyra är aerosolföroreningar i driftmiljön den vanligaste faktorn som orsakar falskt positiva PCR-resultat. Att lägga till UDG-enzym (Uracil DNA Glycosylas, uracil DNA-glykosylas) till amplifieringssystemet kan effektivt eliminera amplifieringsresterna (främst i form av aerosoler) blandade i PCR-systemet för att säkerställa noggrannheten i amplifieringsresultaten. Anti-föroreningsprincipen för UDG-enzymet visas i figur 6.

Figur 6. Schematiskt diagram av anti-föroreningsprincipen för UDG enzym

Yeasen Biotech Uracil DNA Glycosylas (UDG/UNG), värmelabilt, 1 U/μL (Cat#10303ES) är aktivt vid 25-37°C, värmekänsligt och irreversibelt inaktiverat vid 50°C i 10 minuter eller 95°C i 2 minuter. Det finns ingen endonukleas- och RNas-rest, och värdbakteriegenomresten är mindre än 10 kopior. Det kan användas tillsammans med hot-start Taq DNA-polymeras för att säkerställa specificiteten för amplifieringsreaktionen.

4.Kärnenzymer av SARS-CoV-2 nukleinsyradetektering från Yeasen

Angående läsning:

Val av omvänt transkriptas

YEASEN Värmelabil UDG——Kontrollerar enkelt aerosolföroreningar

Murina RNas-hämmare – eliminerar framgångsrikt RNas-kontamination och bevarar RNA