I takt med att människor uppmärksammar hälsorelaterade problem mer och mer, utvecklas området för in vitro-diagnostik (IVD) snabbt. I synnerhet har uppkomsten av COVID-19 påskyndat IVD-marknadens expansion. För närvarande har RT-qPCR använts i stor utsträckning i utvecklingen av IVD-diagnostiska reagensprodukter, men RT-qPCR flytande diagnostiska reagenser har höga transportkostnader, instabil prestanda och kort hållbarhet. Torkande reagenser kan perfekt kringgå bristerna hos RT-qPCR flytande diagnostiska reagenser. Så hur ska torkningsreagens göras? Hur väljer man produktionsmetod?

1. Vad är torkningsreagens?

2. Vad är lufttorkning?

3. Vad är lyofilisering?

4. Vad är skillnaden mellan lyofilisering och lufttorkning?

5. Relaterade produkter och prestanda

1. Vad är torkningsreagens?

Torkningsreagens är de reagens som erhålls efter att provet torkats och dehydrerats. Torkande reagenser kan levereras i rumstemperatur och kräver ingen kylkedjatransport. Det kan undvika upprepad frysning och upptining av reagenser för att påverka reagensernas prestanda och hållbarhet och avsevärt minska transportkostnaderna. Det är inte bara lätt för människor att använda, utan det minskar också kraven på operatörerna. Den molekylära diagnostiska industrin är intresserad av att torka reagens främst för att de kan transporteras och förvaras i rumstemperatur. Det finns nu två allmänt använda torkningstekniker: lyofilisering och lufttorkning. Lufttorkningsteknik är billigare, medan lyofiliseringsteknik är den mest populära, som båda har sina fördelar. Det finns två produktionsmetoder för torkning av reagens: lufttorkning och lyofilisering. Vilka är de och hur ska man välja?

2. Vad är lufttorkning?

Lufttorkning är en torkningsteknik som kan användas för att förbereda torkningsreagenser. Lufttorkning är uppdelad i tre processer: naturlig lufttorkning, varmluftstorkning och imiterad naturlig lufttorkning. I den industriella produktionsprocessen, för att säkerställa stabiliteten i produktkvalitet och produktion, torkas reagenset ofta med varmluftstorkning. För IVD-diagnostiska reagenser används vanligtvis en precisionsugn med blås- eller vakuumfunktion för att torka vätskan vid en temperatur högre än rumstemperatur (torkning vid 50°C i 80 minuter). Vätskan lufttorkas till ett trögflytande torrt material. Den specifika processen visas i figur 1.

Fig 1. Varmluftstorkning

Nyckeln till att torka flytande molekylära reagenser är inte bara att säkerställa att enzymet snabbt kan hydratiseras efter torkning utan också att säkerställa att stabiliteten, känsligheten och specificiteten hos de torkade reagensen inte påverkas. Lufttorkning kräver bara en precisionsugn. Jämfört med lyofilisering är utrustningen billigare och energiförbrukningen lägre, så kostnaden för reagens är lägre. Dessutom är lufttorkningsprocessen enkel och torktiden kortare (inom 2 timmar). Lufttorkning har både fördelar och nackdelar. Under lufttorkningsprocessen kommer olika komponenter inklusive enzymer att gå förlorade vid avdunstning av vatten. Inte bara det utan reaktionslösningen och dess komponenter kommer också att skadas av den höga temperaturen på 50 °C. Vissa komponenter oxideras också lättare, så hållbarheten för lufttorkade reagens blir kortare. Dessutom har det lufttorkande reagenset stark viskositet och är lätt att hänga på väggen och har dålig återfuktningsförmåga.Lyofilisering kan kompensera för bristerna med lufttorkning.

3. Vad är lyofilisering?

Till skillnad från lufttorkning är lyofilisering en speciell torkteknik, vars grundläggande princip är baserad på trefasbyte av vatten. De tre faserna av vatten är fast, flytande och gas, och de tre faserna kan samexistera och transformera varandra. När trycket är större än 610,75 Pa, med temperaturökningen, smälter isen till vatten och vatten förångas och förvandlas till ånga. När trycket är mindre än 610,75 Pa sublimeras isen direkt till vattenånga genom uppvärmning. Specifikt som visas i figur 2. Lyofilisering använder principen om fasövergång av vatten. Först fryses de flytande reagenserna till -30℃~-40℃, så att det mesta av fukten i materialet fryses till is. Isen sublimeras till vattenånga vid ett högre vakuum, vilket ger en lågtemperaturvärmekälla. Vattenångan kondenseras av en kondensor i vakuumsystemet så att annat material blir kvar i isen och på så sätt erhåller torkade produkter.

Fig 2. Fasdiagram för vatten

Så vilka är de huvudsakliga formerna av lyofiliserade reagens? IVD-lyofiliserade reagenser är huvudsakligen indelade i tre former: Penicillin-flaskalyofilisering, in-situ-lyofilisering och lyofiliserad mikrosfär. De tre lyofiliserade formuleringarna visas i figur 3. Olika former har sina fördelar och nackdelar. Penicillinflaska Lyofilisering är den mest industrialiserade formen. Den har inte bara helautomatiska produktionslinjer utan också en komplett verifierings- och riskkontrollprocess. Processen är den enklaste och mest mogna. Nackdelen är att kostnaden för en penicillinflaska är hög, och fyllnadsmängden bör inte vara för liten. Mängden av varje IVD-reagens är dock mycket liten, så den måste fyllas för flera portioner eller användas flera gånger åt gången. Om den inte är förbrukad måste den förvaras separat, och bekvämligheten saknas.

In-situ lyofilisering innebär att alla komponenter i reagenset frystorkas direkt i kitet, vilket är mer bekvämt att använda. Fördelningen av kyla och värme i lyofilisatorn är dock partisk, och placeringen av kiten är också annorlunda, så konsistensen av satser är svår att kontrollera. Dessutom är användningsgraden för in-situ lyofilisatorer mycket låg, så amorteringskostnaden är hög. Om en stor mängd in-situ lyofilisering utförs, kommer de lyofiliserade pulvren att korskontamineras.

Fig 3. Form av lyofiliserade reagens

Lyofiliserad mikrosfär kan uppnå exakt kvantifiering, enstaka person och enskild servering, produkten är mer bekväm att använda. Det kan också behandlas med en speciell process för att förhindra fuktupptagning, uppnå rumstemperaturlagring och lösa flera smärtpunkter samtidigt. Nackdelen är att utvecklingen av Lyophilized Microsphere-teknologi är svår och kraven på processkontroll är höga. Lyofiliserade reagenser måste välja den bästa formen enligt applikationsscenerna. Lyophilized Microsphere har unika fördelar och är lämplig för en mängd olika applikationsscener, som är mer lovande på marknaden.

4. Vad är skillnaden mellan lyofilisering och lufttorkning?

Den unika processen med lyofilisering avgör dess unika fördelar. Jämfört med lufttorkning är lyofilisering överlägsen lufttorkning i många aspekter. Fördelarna med lyofilisering är följande:

Lyofilisering utförs vid låg temperatur, så enzymet kommer inte att denatureras eller förlora biologisk aktivitet, och den biologiska aktiviteten är fullständig.Eftersom torkningen utförs i fruset tillstånd är volymen av torkningsreagenser nästan oförändrad och den ursprungliga strukturen bibehålls utan att krympa. Vid torkning vid låg temperatur är förlusten av vissa flyktiga komponenter i torkningsreagensen mycket liten, vilket är lämpligt för reagenstorkning. Oorganiska salter kommer inte att fällas ut på ytan av materialet under torkning, vilket undviker materialets ythärdning. Det torkade materialet är löst och poröst, löses snabbt och fullständigt efter tillsats av vatten och återställs nästan omedelbart till sin ursprungliga karaktär. Eftersom torkningen utförs under vakuum med mycket lite syre, skyddas vissa lätt oxiderbara ämnen. Torkning kan ta bort mer än 95% till 99% av fukten så att de torkade produkterna kan lagras under lång tid utan att försämras.

De viktigaste skillnaderna mellan lyofilisering och lufttorkning är följande:

Tabell 1. Skillnaderna mellan lyofilisering och lufttorkning

Även om lyofiliserade reagens kostar mer och tar längre tid, är reagensen som produceras genom lyofilisering mer stabila och enklare att använda, vilket är exakt i linje med utvecklingsriktningen för diagnostiska reagens. Därför, sedan tillkomsten av denna teknik, har den blivit mer och mer populär. Det har använts i stor utsträckning inom olika områden som sjukdomsdetektering, virus- och patogendetektering, upptäckt av livsmedelssäkerhet, djurdetektering och miljödetektering.

5. Relaterade produkter och prestanda

Råvaror i IVD-diagnostiska reagenser är nyckeln.Icke frystorkat material kan inte avlägsnas direkt från frystorkat material, och varje komponent måste sållas och felsökas. Därför ökar Yeasen Biotechnology kontinuerligt investeringarna i denna aspekt och strävar efter att förse kunderna med högkvalitativa och stabila lyofiliserade råvaror, som snabbt går ut på marknaden.

De relaterade produkterna som Yeasen kan tillhandahålla visas i Tabell 2:

Tabell 2. Lista över produkter

Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Kit (med MgCl2) (Cat#13775) är ett glycerolfritt, lyofiliseringskompatibelt (lyo-ready) flytande diagnostiskt reagens. Denna produkt är ett idealiskt val för utveckling av multiplex RT-qPCR som har rumstemperaturstabilitet och som kan skickas och förvaras i rumstemperatur.

Prestanda: Pseudovirusmallen amplifierades med flera RT-qPCR med hjälp av flytande reagens (röd) respektive 13775 lyofiliserade reagens (lila). Den vänstra grafen är FAM-kanalen, den högra är VIC-kanalen. Resultaten visade att aktiviteten hos 13775-reagensen var intakt efter lyofilisering, och den hade fortfarande högeffektiv multipelreaktionsförmåga. Specifikt som visas i figur 4.

Fig 4. Prestandan för 13775-produkten efter lyofilisering

De 13775 lyofiliserade reagensen placerades vid 37°C (grön) och -20°C (blå) under 21 dagar för multipla RT-qPCR-amplifieringstester. Den vänstra grafen är FAM-kanalen, den högra är VIC-kanalen. Resultaten visade att det lyofiliserade reagenset fortfarande hade en god amplifieringseffekt efter att ha placerats vid 37°C under 21 dagar. Specifikt som visas i figur 5.

Fig 5. Termisk stabilitet för 13775 lyofiliserat reagens—37°C i 21 dagar.

6.Produktvalsguide

Behandla	Beskrivning	Produktnamn	SKU
Provbearbetning	Proteinnedbrytning	Proteinas K	10401ES
	RNA-extraktion	Rekombinant DNas I (RNas-fri)	10325ES
	RNas-hämning	Murin RNas-hämmare (40 U/μL)	10603ES
Omvänd transkription	Lämplig för RT-qPCR	Hifair V omvänt transkriptas (200U/μL)	11300ES
		Hifair V omvänt transkriptas (600U/ μL) Glycerol-fri	11301ES
PCR-amplifiering	Varmstartad DNA-polymeras	Hieff UNICON Hotstart E-Taq DNA-polymeras	10726ES

Angående läsning:

Covid-19 nukleinsyradetektering råmateriallösning: snabb, frystorkad

Yeasen Biologys övergripande lösning för upptäckt av afrikansk svinpestvirus

Afrikansk svinpestvirus - Total Master Mix/Direkt Amplifiering qPCR-lösning