Med den snabba utvecklingen av bioteknik har mRNA-terapi, som en framväxande behandlingsmetod, väckt stor uppmärksamhet på grund av dess starka programmerbarhet och snabba svarshastighet. Inom områdena mRNA-vacciner och genterapi är effektiv syntetisering av högkvalitativt mRNA ett nyckelsteg för att uppnå terapeutiska mål. Under denna process spelar T7 RNA-polymeras (T7 RNAP) en viktig roll, det kan effektivt katalysera in vitro-syntesen av mRNA.
Även om T7 RNAP spelar en avgörande roll i mRNA-syntes, producerar det ofta dubbelsträngat RNA (dsRNA) som en biprodukt i praktiken. dsRNA är ett av kännetecknen för många virus, och därför känns det lätt igen av intracellulära dsRNA-bindande proteiner, vilket utlöser medfödda immunsvar och inflammatoriska reaktioner. Detta betyder att om mRNA-formuleringar innehåller en högre nivå av dsRNA kan det leda till onödig immunaktivering, vilket kan påverka den terapeutiska effekten eller orsaka allvarliga biverkningar. För mycket dsRNA kan också störa den normala funktionen av mRNA, inklusive translationseffektivitet och mRNA-stabilitet, vilket indirekt påverkar effektiviteten av mRNA-terapi.
Figur 1: Effekten av dsRNA-biprodukter och den optimerade T7 RNAP-reaktionen.
Att utveckla och anta effektiva metoder för att minska genereringen av dsRNA är därför en avgörande del av utvecklingen av mRNA-teknologi. Forskare har utvecklat olika strategier, inklusive användningen av förbättrade T7 RNA-polymeraser, modifieringsnukleotider, optimering av IVT-transkriptionsbuffertar och nedströmsreningsprocesser. Yeasen Biology använder kapaciteten hos sin ZymeEditor-riktade evolution-plattform för att kontinuerligt utveckla kärnenzymråmaterialet för mRNA in vitro-syntes – T7 RNA-polymeras. Vi har utvecklat ett lågt dsRNA T7 RNA-polymeras som undertrycker RDRP-aktiviteten hos T7 RNA-polymeras, vilket i grunden minskar bildningen av dsRNA, och därigenom sänker innehållet av dsRNA avsevärt.
Produktdata
Utbyte: över 9 mg/ml
dsRNA-innehåll: innehållet av dsRNA har reducerats avsevärt med minst 10 gånger
Beläggningseffektivitet: över 99 %
Lågt dsRNA T7 RNA-polymeras Screeningprocess:
1) konstruktionen av ett slumpmässigt bibliotek och FADS high-throughput screeningmetod, ett slumpmässigt mutationsbibliotek på över 10^6 screenades.
2) semi-rationell design och mikroplattteknik användes för att screena ett platsmättat bibliotek. Båda metoderna gav låga dsRNA T7 RNA-polymerasmutanter. Med tanke på dsRNA-innehållet samtidigt som man säkerställer att andra indikatorer inte reduceras (som integritet/takeffektivitet/utbyte, etc.), flera mutanter selekterades och en med namnet CleaScrip™ T7 användes för kommersiell tillämpning.
Produktdata
I appliceringsscenarier med olika längd har lågt dsRNA T7 RNA-polymeras visat en mycket signifikant minskning jämfört med både WT T7 och konkurrerande produkter, samtidigt som det säkerställs att utbyte och integritet inte minskar.
| Fragmentets längd | T7 RNA pol | Avkastning(mg/ml） |
Integritet(%） | dsRNA-innehåll (ng dsRNA producerat per 1 ug RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| CleaScrip™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Företag A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9.5 | 81,9 | 2,9180 |
| CleaScrip™ T7 | 9,0 | 82,0 | 0,0379 | |
| Företag A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
Använder en cap-koncentration på 2,5 mM, kan utmärkt kapningseffektivitet fortfarande uppnås över olika fragmentlängder jämfört med WT. Dessutom observeras överlägsen proteinuttrycksprestanda också på cellulär nivå.
| Cap analog ingång（mM） | Kapslingseffektivitet (%）4K | |
| WT | Lågt dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Patent har lämnats in i USA.
Produktinformation
| Produktnamn | Katalognummer | Specifikation | Volym |
| CleascripTM T7 RNA-polymeras (lågt dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25 000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| CleascripTM T7 RNA-polymeras GMP-kvalitet (lågt dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25 000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |