De dskrift av T7 High Yield RNA Synthesis Kit
T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimerar transkriptionsreaktionssystemet. Satsen kan syntetisera det enkelsträngade RNA:t effektivt genom att använda T7 RNA-polymeras, den lineariserat dubbelsträngat DNA med T7-promotorsekvensen som mall, NTP som substrat för att transkribera DNA-sekvensen nedströms om promotorn. Under transkription kan modifierade nukleotider också tillsättas som substrat för att producera biotin eller färgämnesmärkt RNA.
Detta kit kan syntetisera både långa transkript och korta transkript, RNA kan produceras 100-200 μg med 1 μg DNA-mallinmatning. Det RNA som syntetiseras genom transkription kan användas för olika nedströmsapplikationer, såsom RNA-struktur och -funktionsforskninghes, RNas-skydd, probhybridisering, RNAi, mikroinjektion och in vitro-translation.
Syntesprincip
Figur 1: In vitro RNA-transkriptionsprocess
Produktfördelar
Hög avkastning: kan producera upp till 200 μg på 2 timmar genom transkriptionsreaktion
Bättre mångsidighet: lämplig för transkription av 20nt-10000nt RNA
Utmärkt prestanda: reducerar effektivt biprodukterna av transkription under IVT-processen
Flera applikationer: kan användas för vanlig, märkt och modifierad RNA-syntes
Produktegenskaper
Figur 2: Utbyte av transkript av olika längd
Figur 3: Kvalitet på utskrifter av olika längd
Figur 4: Uttryck för transkriberas mRNA i HEK-293 celler
Obs: mRNA har täckts med Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).
Experimentella metoder
Upptining av reagenserCentrifugera T7 RNA Polymerase Mix kort och placera det på is. Tina 10× transkriptionsbuffert och ribonukleotids (ATP, CTP, GTP, UTP), blanda och centrifugera till botten av röret, placera 10 x transkriptionsbuffert vid rumstemperatur och placera 4 typer av ribonukleotider på is.
B.Montering av transkriptionsreaktion vid rumstemperaturFörbered reaktionssystemet enligt följande system:
| Komponenter | Volym (µL) | Slutlig koncentration |
| RNase-fri H2O | Upp till 20 | - |
| 10×Transkriptionsbuffert | 2 | 1× |
| CTP/GTP/ATP/UTP (100 mM vardera) | 2 st vardera | 10 mM vardera |
| Mall-DNA | 1 µg | - |
| T7 RNA-polymerasblandning | 2 | - |
Anmärkningar:
- Reaktionen konfigureras vid rumstemperatur. Eftersom 10× transkriptionsbuffert innehåller spermidin kan den höga koncentrationen av spermidin orsaka DNA-mallfällning vid låg temperatur.
För korta transkript (<100 nt) kan 2 µg mall användas, transkriptionstiden förlängs till 4-8 timmar.
3. För långa transkript (>1000 nt), rekommenderas att använda linjäriserade plasmider som mallar för transkription.
4. Utför reaktionen i PCR-instrumentet med det varma locket öppet för att förhindra avdunstning.
5. Reaktionsprodukten kan ha en vit fällning. Fällningen är magnesiumpyrofosfatet som produceras av de fria pyrofosfat- och magnesiumjonerna i reaktionslösningen vilket inte påverkar de efterföljande experimenten. Om du vill ta bort det kan du lägga till lite EDTA. Om tillsatsen av EDTA påverkar efterföljande experiment, kan supernatanten också utvinnas genom centrifugering.
6. Förvara reagenserna och behållarna utan RNas-kontamination.
Blanda komponentlösningen, centrifugera kort till botten av röret och inkubera vid 37°C i 2 timmar. Om transkriptionslängden är mindre än 100 nt, förläng reaktionstiden till 4-8 timmar.
D.DNas I-behandling (valfritt)När reaktionen är klar, tillsätt 2 μL DNas I (RNase-fri) till varje rör och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att ta bort mall-DNA:et.
Vanliga frågor
- Lågt avskriftsutbyte
Kvaliteten på mallen är nära relaterad till avkastningen. Utbytet av experimentgrupp är betydligt lägre än kontrollgruppen. De möjliga orsakerna är:
- Den experimentella mallen innehåller hämmande komponenter;
- Mallen kanske har något fel.
Förslag: ① Rensa mallen igen; ② Bestäm mallens kvantifiering och dess integritet; ③ Förläng reaktionstiden; ④ Öka mängden mallinmatning; ⑤ Använd andra promotorer och andra RNA-polymeraser.
- Lågt utbyte av korta avskrifter
Korta mallfragment kan hämma reaktionen. När transkriptionsprodukten är mindre än 100 nt, om du vill öka utbytet, förläng reaktionstiden till 4-8 timmar eller öka mängden mall till 2 μg.
- RNA-transkriptionslängden är större än väntat
Om elektroforesresultat visar att produktbandet är större än den förväntade storleken kan möjliga orsaker vara: ① Plasmidmallen kanske inte är helt linjäriserad; ②3'-änden av avkänningssträngen har en framträdande struktur; ③ RNA:t har en sekundär struktur som inte är fullständigt denaturerad.
Förslag: ①Kontrollera om mallen är helt linjäriserad, och vid behov, utför ytterligare linjärisering; ②Välj ett lämpligt restriktionsenzym för att undvika 3'-överhäng, eller använd Klenow Fragment /T4 DNA-polymeras för att slutföra transkriptionen innan du fortsätter; ③Använd denaturerad gel för att detektera RNA-produkter.
- RNA-transkriptionslängden är mindre än väntat
Om elektroforesen visar att produktbandet är mindre än den förväntade storleken, de möjliga orsakerna är: ① Mallen innehåller en termineringssekvens som liknar T7 RNA-polymerasterminator; ②GC-innehållet i mallen är för hög.
Förslag: ①Sänk reaktionstemperaturen (till exempel 30°C). Ibland kan en sänkning av temperaturen bidra till att förlänga transkriptionslängden, men det kan det minska avkastningen. Prova annat RNA-polymeraser för transkription; ②Om mallens GC-innehåll är högt, utför reaktionen vid 42 ℃ eller lägg till SSB för att öka utbytet och transkriptionslängden.
- Elektroforetisk svansning av transkriptionsprodukter
Svans under elektrofores kan orsakas av: ① RNas-kontaminering under den experimentella operationen; ②DNA-mallen är kontaminerad med RNaser.
Förslag: ①Använd RNase-fria pipettspetsar och EP-rör, använd latexhandskar och engångsmasker, och alla reagenser är förberedda med RNase-fritt H2O. ②Rena mallens DNA igen.
Beställningsinformation
| Produktnamn | Katalognummer | Sspecificering |
| 10623ES | 50/100/500 T | |
| 10625ES | 10KU/100KU/2500KU/25MU | |
| 10620ES | 10U/100U/1000U | |
| 10621ES | 10KU/20KU/100KU/1MU | |
| 10614ES | 2KU/10KU/100KU | |
| 10612ES | 10KU/50KU/250KU | |
| 10611ES | 500/2000/10 000 U | |
| 12603ES | 24/96 T |