Den här artikeln beskriver tillämpningen av Concanavalin A och dess kovalenta koppling med magnetiska pärlor.
Del 1. Concanavalin A
Concanavalin A-Coated Magnetic Beads (ConA-pärlor), som namnet antyder, är biomagnetiska pärlor där växtlektinet Concanavalin A (ConA) är kopplat till superparamagnetiska nanomaterial. Följande är en kort introduktion till ConA Magnetic Beads.
Concanavalin A (ConA), ett växtlektinprotein utan blodgruppsspecificitet, var det första växtlektinproteinet som isolerades och renades och kristalliserades från bläckböna (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) sedan 1936.
ConA har 2 huvudformer beroende på pH i lösningen i vilken den finns: α-2-homodimeren eller α-4-homotetrameren [2]. Under alkaliska betingelser (pH>7,0) existerar den som en tetramer (bestående av fyra molekylviktssubenheter på 26 kDa); under sura betingelser (pH 4,5-5,5) dissocierar Con A till en aktiverad dimer struktur (52 kDa). Dessutom påverkas ConA-funktionen av tvåvärda katjoner, t.ex. i frånvaro av metalljoner (Ca)2+ och Mn2+) kan dess konformation och glykoproteinbindande funktion inte realiseras[1].
Fig. (1). Molekylär modellering av (A) ConA-monomer, (B) ConA-dimer, (C) ConA-tetramer med mannos, glukos och metalljoner.
Del 2. Pärlor
Biomagnetiska pärlor är en klass av magnetiska mikrosfärer med nanometerpartikelstorlek, bildade av polymerer och oorganiska magnetiska nanopartiklar. Magnetiska pärlor kan klassificeras i tre huvudkategorier beroende på deras struktur: kärna-skal typ struktur, sandwich typ struktur och diffus typ struktur. Magnetiska material inkluderar rent järnpulver, karbonyljärn, magnetisk malm, orthoferrit och järnkoboltlegering, et al.
Magnetiska nanomaterial, på grund av deras specialeffekter, såsom liten storlekseffekt, yteffekt och kvantstorlekseffekt, etc., i storleken Fe3O4 nanopartiklar är mindre än 30 nm, störningen av den termiska störningen inuti nanopartiklarna är betydande, och vid denna tidpunkt visar dessa nanopartiklar en speciell magnetisk egenskap, dvs superparamagnetism. Superparamagnetisk Fe3O4 nanopartiklar används i stor utsträckning inom den biologiska industrin på grund av deras högkvalitativa egenskaper, såsom icke-toxicitet, god biokompatibilitet, unika magnetiska målegenskaper och lätthet att generera värme i alternerande magnetfält.
Däremot har kovalent koppling av ConA med mikrosfärer för immobilisering av biomolekyler följande fördelar:
- Hög stabilitet av kovalent kopplingsbindning för reproducerbarhet;
- Ligand ConA-bindning på ytan av mikropärlor för målmolekylinteraktioner;
- Kinetisk karakterisering av lösningsmiljön, lämplig för biologisk experimentell manipulation;
Del 3. Applicering av ConA magnetiska pärlor
Som rapporterats i litteraturen är de huvudsakliga tillämpningarna av ConA magnetiska pärlor kategoriserade i 3 scenarier, som utför cytoplasmatisk membranseparation, glykoproteinberikning och separation av immobiliserade cellulära aspekter.
Applikation I: Cytoplasmatisk membranseparation
Använda ConA magnetiska pärlor som påverkas av aktiveringen av tvåvärda katjoner, så att den existerar i Ca2+ och Mg2+ lösningsmiljöer, som har funktionen av affinitetsinteraktion av terminal α-D-mannosyl och α-D-glukosyl, som används vid plasmamembranrening, är ett enkelt och effektivt sätt. Till exempel är plasmamembranseparation av celler eller vävnader ett nyckelsteg för att ytterligare erhålla plasmamembranproteiner. ConA kan binda glykosylerade proteiner på celler, och denna princip kan användas för att erhålla plasmamembran med högre renhet. De huvudsakliga operationsstegen är: immobilisering av ConA på magnetiska pärlor genom att binda biotinylerat ConA till streptavidin magnetiska pärlor; inkubation av cellmembran med ConA magnetiska pärlor under 1 timme; adsorption på ett magnetstativ; tvätta med TBS i 5 gånger; och eluering av cytoplasmatisk membranlösning med elueringsmedel[3].
Fig 2. ConA magnetiska pärlor reningssteg för plasmamembran
Användning II: Glykoproteinberikning
ConA är specifik för mannos och glukos och känner igen α-konjugerad mannos, som råkar vara "kärnoligosackariden" i många serum- och cellmembranglykoproteiner. Därför kan den användas inom immunologi för att separera glykosylerade molekyler såsom glykoproteiner i cell- eller vävnadslysat eller serum.
En stor procedur var det genom tvärbindning av aminosilaniserade magnetiska nanopärlor (MNP) med ConA via en bifunktionell länk, bis-N-hydroxisuccinimidlinoleat (DSS), för att erhålla magnetiska ConA-pärlor; att avsluta den icke-specifika bindningen av de magnetiska nanopärlorna med användning av metoxietylenglykol (MEG), och att utföra den magnetiska separationen; att tillsätta extraktet av de cellulära membranproteinerna spjälkade med trypsin för att inkubera både de magnetiska ConA-pärlorna och de infångade glykopeptiderna, och slutligen för att eluera de infångade glykopeptiderna och att utföra vakuumtorkning. ConA magnetiska pärlor inkuberades båda, de magnetiska ConA pärlorna som hade bundna glykoproteiner samlades upp av magnetstativet, icke-glykopeptiderna tvättades och slutligen eluerades de infångade glykopeptiderna och vakuumtorkades. Denna metod möjliggör en djupgående analys av specifika glykosyleringsställen för tumörassocierade proteiner (t.ex. EGFR)[4].
Fig 3. Superparamagnetiska nanopartiklar kopplade till olika lektiner
Applikation III: Isolering av immobiliserade celler
Användningen av ConA magnetiska pärlor (magnetiska pärlor kovalent bundna till högrenhetskompanjon Concanavalin A) för att binda till glykoproteiner på cellmembran eller kärnmembran, och därigenom fånga celler eller kärnor, möjliggör visualisering av experimentell manipulation av ett litet antal celler. Till exempel används ConA magnetiska pärlor i CUT&Tag och CUT&RUN [5] experiment, som är nya tekniker som används för att studera strukturen och funktionen av kromatin, och som immobiliseras genom att binda ConA magnetiska pärlor till cellerna för att visualisera operationen och undvika problemet med cellförlust orsakad av centrifugering.
Jämfört med den traditionella ChIP-seq-teknologin för att studera DNA-proteininteraktioner har CUT&Tag och CUT&RUN följande fördelar:
- ConA magnetiska pärlor binder till cellmembranets glykoproteiner för att visualisera operationen och förbättra den experimentella operationsupplevelsen;
- Inget behov av centrifugering, bara ConA magnetiska pärlor adsorberade på magnetstativet för att slutföra separationen av cellprover och lösningar;
- Kan drivas med så lite som 10 celler, vilket kringgår behovet av ett stort antal prover för ChIP-seq.
Fig. 4. Schematiskt diagram av ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN experimentflöde
Del 4. YEASEN Concanavalin A-belagda magnetiska pärlor
ConA magnetiska pärlor, utvecklade av YEASEN, kan binda till glykoproteiner, glykolipider, polysackarider och andra molekyler med glykosyleringsmodifiering på ett snabbt, effektivt, känsligt och specifikt sätt efter strikt val av råmaterial och flera processoptimeringar och förbättringar. Den används främst för cellisolering eller för isolering av glykosylerade molekyler såsom glykoproteiner i cell- eller vävnadslysat eller serum, och används särskilt direkt för experiment som CUT &RUN och CUT&Tag (en innovativ teknologi för ChIP-seq experiment).
1.Produktegenskaper
- Stabil batchproduktion och bättre reproducerbarhet av resultat;
- Stabil prestandalagring
- Cellfångningseffektivitet >90 %
2. Produktinformation
| Katt NR. | Katt#19810ES |
| Storlek | 1mL/5mL/20mL |
| Färg | Brungul |
| Pärlkoncentration | 10 mg/ml |
| Solid innehåll | 9-11 mg/ml |
| Pärlstorlek | 1 µm |
| Kapacitet | 105 celler/µL pärlor |
3. Produktprestandadata
(1)Monodispersitet
Under samma behandlingsförhållanden och under förstoringen 10×/40× var ConA-pärlorna i princip monodispergerade och ingen uppenbar agglomeration observerades i förhållande till konkurrenten.
| YEASEN Råmaterial pärlor | Konkurrent ConA-pärlor | YEASEN ConA pärlor（Cat#19810） |
Fig 5. Graf över monodispersitetsresultat
(2) Effekt av ConA-pärlor som binder cell
Samma antal celler inkuberades med pärlorna under samma tid, och antalet kvarvarande celler efter konjugering av ConA-pärlorna detekterades automatiskt under cellanalysatorn, och resultaten visade att YEASEN ConA-pärlor (Cat#19810) överträffade konkurrentens produkter.
| Cellsuspension | Celler kvar efter bindning av konkurrerande ConA magnetiska pärlor | Celler kvar efter bindning av YEASEN ConA magnetiska pärlor |
Fig 6.Bild på ConA magnetiska pärlbundna celler
(3) Cellbindningsnummer och repeterbarhet
Både 10µL YEASEN ConA Beads (Cat#19810) och 10 µL Competitor ConA Beads, binder E7-nivåantal av celler som är jämförbara med konkurrenten. Cellinfångningen var >90 % under upprepade operationer.
Fig 7. Resultaten av ConA-pärlor som binder cellantal och fångsthastighet
(4)Accelerationsstabilitet
Dispensera med 1 ml/rör. Lagringsförhållandena var: 4℃, 37℃ accelererad behandling i 2, 4, 7, 11 och 14 dagar, och -20℃ destruktionsbehandling i 1, 3, 6 och 8 dagar. Resultaten visade att under samma experimentella förhållanden: cellinfångningshastigheten för produkterna lagrade vid 4 ℃, accelererad behandling vid 37 ℃ och destruktionsbehandling vid -20 ℃ var >95 %, och CV-värdet för de tre grupperna av replikat under varje behandlingstillstånd var inom 1 %, vilket visade god reproducerbarhet.
Fig 8. Resultaten av cellfångningshastighet och repeterbarhetsbias för ConA-pärlor under olika temperatur och tid
Beställningsinformation
| 19810ES |