Omfattande guide till organoidodling

— En omfattande artikel för att fördjupa din förståelse av organoider.

Introduktion till organoider

Organoider är tredimensionella strukturer med fysiologiska funktioner som efterliknar det normala (eller sjuka) tillståndet hos inre organ eller vävnader, uppnått genom 3D-odling utanför kroppen. I enklare termer är organoider tredimensionella cellkulturer där stamceller odlas i en matrisgel. Under påverkan av kemiska inhibitorer/aktivatorer, cytokiner och odlingstillsatser utvecklas organoider till vävnadsstrukturer som liknar motsvarande organ.

Egenskaper hos organoider

Organoider har självförnyelseförmåga, upprätthåller källvävnadens fysiologiska struktur och funktion. De kallas ofta för "mikroorgan i en maträtt". Genom att använda stamcellers självförnyelse, differentiering och självorganiserande förmåga kan organoider kryokonserveras för användning i biobanker och kan genomgå obegränsad expansion. Organoider är mycket komplexa och, jämfört med 2D-celler, liknar de mer in vivo-tillståndet.

Figur 1. Organoid odling av humana kolonadenokarcinomceller [1]

Tillämpningar av organoider

Det utmärkande för organoider är deras förmåga att bättre simulera miljön in vivo, vilket gör dem lämpliga för molekylär- och cellbiologiska analyser. Genom att överbrygga gapet mellan djur- och cellnivåer erbjuder organoider en överlägsen lösning för forskning inom områden som tumörstudier, läkemedelsscreening, regenerativ medicin och mer. De har använts i stor utsträckning inom funktionell vävnadsinduktion, etablering av sjukdomsmodeller, läkemedelsscreening, antiinflammatoriska tester, klinisk forskning och olika andra forskningsaspekter, vilket visar stor potential i både grundforskning och translationella tillämpningar.

Eftersom organoida odlingssystem och experimentella tekniker fortsätter att utvecklas, har organoider använts för olika vävnader och organ, inklusive tarmar (tunntarm/tjocktarm), mage, lever, hjärta, lungor, prostata, bukspottkörtel, njurar, bröst, hjärnliknande strukturer, näthinnan, innerörat och mer.

Organoider som härrör från tumörstamceller har visat betydande potential för att förstå mekanismerna för tumöruppkomst och utveckling, screening av läkemedelskänslighet och främjande av precisionsmedicin och personlig diagnos. Flera artiklar från Cell and Science indikerar att organoider uppvisar hög känslighet och specificitet när det gäller att förutsäga effektiviteten av läkemedel mot cancer. På senare tid har tumörorganoider visat sin roll i att förutsäga patienternas svar på cancerläkemedel och hjälpa till vid utformningen av personliga behandlingsplaner.

Forskning om utvecklingsmekanismer: Organoiders differentieringsförmåga gör dem lämpliga för att studera embryonala utvecklingsprocesser och mekanismer. Induktionsprocesserna som regleras av signalvägar som Wnt och BMP kan användas för att studera utvecklingen av organ som hjärnan, bukspottkörteln och magen [2][3][4].

Etablering av sjukdomsskademodeller: Organoider inducerade från specifika vävnader eller organ kan användas för att studera modeller av specifika sjukdomar. Team ledda av Zhao Bing och Lin Xinhua använde mänskliga organoidinfektionsmodeller för att studera de molekylära mekanismerna för SARS-CoV-2-infektion och leverskador, vilket gav avgörande verktyg för att forska om virusets patogena mekanismer och efterföljande läkemedelsutveckling [5]. Forskargruppen ledd av Deng Hongkui vid Peking University's School of Life Sciences använde små molekyler och cytokiner för att stimulera konstruktionen av en ny intestinal organoid med egenskaper av skaderegenerering - Hyper Organoid.Denna organoid kan passeras och förstärkas under en längre period, bibehålla genomet och främja reparationen av tjocktarmsvävnadsskada, lindra de patologiska symtomen i en djurmodell för akut kolit och mer [6].

Regenerativ medicin: Organoider som härrör från stamceller kan reparera eller ersätta skadade eller sjuka vävnader för att återställa normal vävnadsfunktion. De har omfattande tillämpningar inom cellterapi, inklusive för andra neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, retinala sjukdomar, ryggmärgsskador och mer. Som en ny behandling inom området regenerativ medicin - DA01, med användning av små molekyler som SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 och Sonic Hedgehog (Shh) protein, stimulerar pluripotenta stamceller att differentiera till dopaminer. Dessa neuroner transplanteras sedan in i de skadade områdena i hjärnan hos patienter med Parkinsons sjukdom i sent skede, vilket ger en ny riktning och tillvägagångssätt för behandling av sjukdomen [7].

Testning av läkemedelstoxicitet och effekt: Organoider kan användas för att verifiera farmakotoxiciteten hos nya läkemedel i specifika organ eller vävnader, vilket ger datastöd för utveckling av nya läkemedel. Användningen av Hyman njurorganoider för att verifiera den renala toxiciteten av Cisplatin är ett exempel [8].

Läkemedelsscreening: Organoider som härrör från stamceller kan användas för in vitro-testning av läkemedelsreaktioner, vilket ger teoretiskt stöd för läkemedelsscreening. Kolonorganoider kan användas för att studera medicineringsplaner för patienter med CFTR-mutationer, och tumörorganoider kan användas för att bedöma individualiserade medicineringssituationer för patienter [9].

Utvecklingshistoria av organoider

Källor till organoider

Normala organoider härstammar främst från stamceller, inklusive pluripotenta stamceller (PSC) och vuxna stamceller (ASC). Pluripotenta stamceller inkluderar embryonala stamceller (ESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Jämfört med pluripotenta stamceller har vuxna stamceller fördelen av att vara enklare och snabbare att modellera, men nackdelen med att konstruera organoida strukturer som är relativt enklare. Organoida strukturer konstruerade från pluripotenta stamceller är mer komplexa.

Produkter som används i Organoidodling

Vanligt använda små molekyler i organoidkultur (sammanfattning): Superpraktiskt, glöm inte att bokmärka!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): En potent hämmare av rock, som kompetitivt hämmar p160ROCK (Ki=140 nM) och ROCK-II (IC50=800 nM) genom ATP-konkurrens.Det hämmar också PRK2 (IC50=600 nM). Tillsätts vanligtvis under den första sådd i plattodling; efterföljande mediumändringar kanske inte kräver tillägg. Behandling av mänskliga embryonala stamceller med Y-27632 (10 µM) under 1 timme kan hämma apoptos, öka kloneffektiviteten och förlänga cellpassager.

Rekommenderad arbetskoncentration: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): En effektiv p38 MAPK kinashämmare, inriktad på p38α/β. SB202190 kan inducera differentiering av mänskliga embryonala stamceller till hjärtmuskelceller, främja självförnyelse av neurala stamceller och är tillämplig på odling av gastrointestinala och bröstkörtelorganoider.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 10 mg i 3,018 mL DMSO för att erhålla en 10 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Ett aminopyrimidinderivat som fungerar som en GSK-3 (GSK3α/β)-hämmare. Det inducerar differentiering av mänskliga embryonala stamceller in i endodermen och används i njure och retinala organoidkulturer. CHIR-99021, när den används i kombination med andra reagens, stimulerar somatisk cellomprogrammering till stamceller.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 5 mg i 3,58 mL DMSO för att erhålla en 3 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): En Activin/NODAL/TGF-β-väghämmare som hämmar ALK5/4/7 kinasaktivitet. Används vanligtvis i odling av organoider i lever, prostata och bröstkörtel. Det används vanligtvis för att hämma differentieringen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och upprätthålla självförnyelsen av celler in vitro.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 5 mg i 5,93 mL DMSO för att erhålla en 2 mM lösning; lagra vid -20 ℃. (Obs: Denna produkt är instabil i lösning och rekommenderas för omedelbar användning efter beredning.)

Rekommenderad arbetskoncentration: 2 μM

❺ Gastrin I (Cat#53007ES): Gastrin är ett endogent gastrointestinalt peptidhormon som stimulerar magceller att utsöndra magsyra. Det är avgörande för studier av gastrointestinala organoider. Vid odling av organoider från tarm och lever hjälper tillsats av gastrin till att förlänga överlevnadstiden för organoider.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 1 mg i 2,38 mL 1% ammoniaklösning för att erhålla en 0,2 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 10 nM

❻ Nikotinamid (Cat#51402ES): Nikotinamid, ett B3-vitamin, deltar i olika enzymatiska redoxreaktioner och används i odlingen av organoider från mag-, lever- och bröstkörtel. Nikotinamid, i kombination med cytokiner och andra biokemiska reagens, uppvisar antiinflammatoriska egenskaper, främjar differentieringen av mesenkymala stamceller till insulinproducerande celler, hämmar sirtuins aktivitet och används för att främja organoidbildning och förlänga organoidlivslängd.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 100 mg i 8,19 mL H2O (eller DMSO) för att erhålla en 100 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 10 mM

❼ Forskolin (Cat#51001ES): Forskolin kan aktivera adenylatcyklas, som vanligtvis används för att höja intracellulära cAMP-nivåer. Forskolin inducerar differentiering av olika celltyper, aktiverar PXR och FXR och har antiblodplättsaggregation och antihypertensiva effekter. Vid odling av leverorganoider är det viktigt att tillsätta detta ämne.

Rekommenderad arbetskoncentration: 1-10 μM

❽ Prostaglandin E2 (Cat#60810ES): Prostaglandin E2 (PGE2) reglerar många fysiologiska system, förmedlar cellproliferation och differentiering.Det behövs vid odling av lever- och prostataorganoider och är förknippat med glattmuskelavslappning, inflammation, reproduktion, sömncykelreglering och magslemhinnans integritet.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 1 mg i 0,28 mL DMSO för att erhålla en 10 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 500 nM

❾ N-acetyl-L-Cystein (Cat#50303ES): N-acetyl-L-cystein (NAC) är en föregångare till antioxidanten glutation, med antioxidant- och ROS-hämmande effekter. Det hämmar neuronal cellapoptos och krävs i odlingsprocessen av de flesta organoider.

Rekommenderad upplösningskoncentration: Lös 2 g i 24,51 mL H2O (eller DMSO) för att erhålla en 500 mM lösning; lagra vid -20 ℃.

Rekommenderad arbetskoncentration: 1 mM

Relaterad produktinformation

Referenser:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Långsiktig expansion av epiteliala organoider från human kolon, adenom, adenokarcinom och Barretts epitel. Gastroenterologi. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 2 sep. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Cerebrala organoider modellerar mänsklig hjärnans utveckling och mikrocefali. Natur. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Konstgjorda tredimensionella nischer dekonstruerar utvecklingen av bukspottkörteln in vitro. Utveckling. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modellering av mänsklig utveckling och sjukdom i pluripotenta stamcellshärledda magorganoider. Natur. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulation av SARS-CoV-2-infektion och kolangiocytskador med humana leverorganoider. Proteincell. 2020 okt;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Etablering av intestinala organoidkulturer som modellerar skadarelaterad epitelregenerering. Cell Res. 2021 Mar;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 8 januari. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics tillkännager första patienten doserad med DA01 i fas 1-studie på patienter med avancerad Parkinsons sjukdom. BlueRock Therapeutics pressmeddelande: 8 juni 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Njurorganoider från mänskliga iPS-celler innehåller flera linjer och modellerar mänsklig nefrogenes. Natur. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Riktad differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till tarmvävnad in vitro. Natur. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.