HEK293 Host Cell Residual DNA Fragment Analysis Kit är designat för kvantitativ analys av HEK293-rest-DNA-fragment av olika längd i mellanprodukter, halvfabrikat och slutprodukter från biologiska preparat. Detta kit använder qPCR-fluorescensprobprincipen för att specifikt och snabbt detektera HEK293 DNA-rester både under och över 200 baspar, med en kvantifieringsgräns så låg som 10 fg/μL. Den inkluderar också HEK293 DNA-kontroll (DNA kvantitativ referens). Detta kit kan användas tillsammans med företagets magnetiska pärlor-baserade rest-DNA-provberedningssatser (Katt#18461ES/18462ES).

Produktinformation

Komponent

Förvaring och frakt:

1. Alla komponenter levereras på torris och bör förvaras vid -25°C till -15°C vid mottagandet. Hållbarheten är 2 år. Komponenterna A och B1, B2, B3 och B4 bör förvaras skyddade från ljus.

2. Vid mottagande, verifiera att alla 7 komponenterna finns och förvara dem omedelbart vid rekommenderade temperaturer.

Försiktighetsåtgärder:

1. Denna produkt är endast avsedd för forskningsändamål.

2. Av säkerhets- och hälsoskäl, vänligen bär laboratorierockar och engångshandskar under drift.

3. Innan du använder detta reagens, läs noggrant igenom bruksanvisningen. Experiment bör utföras enligt standardprocedurer, inklusive provhantering, beredning av reaktionsblandningar och pipettering.

4. Varje komponent ska blandas noggrant genom försiktig skakning och kort centrifugeras före användning.

Kompatibla instrument:

Inklusive men inte begränsat till följande instrument: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: CFX96 optisk modul, Shanghai Hongshi Medical Technology: SLAN-96S

Bruksanvisning

1. Spädning av HEK293 DNA-kontrollkvantitativ referens och beredning av standardkurvor

HEK293 Fragment Analysis Kit innehåller fyra amplifieringsfragment av olika längder: 82 bp, 133 bp, 227 bp och 515 bp. När du upprättar standardkurvor, sätt upp separata kurvor för varje amplifieringsfragment och beräkna deras restmängder och relativa fördelningar baserat på motsvarande standardkurvor.

Använd DNA-spädningsbufferten som medföljer i satsen för att utföra en gradientspädning av HEK293 DNA-kontrollkvantitativ referens. Spädningskoncentrationerna bör vara: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL och 30 fg/μL.

Detaljerna är som följer

1). Placera HEK293 DNA Control och DNA Dilution Buffer från kitet på is för att tina. Efter fullständig upptining, vortexa försiktigt för att blanda och centrifugera kort (10 sekunder) för att samla upp lösningen i botten av röret.

2). Förbered sex rena 1,5 mL centrifugrör och märk dem som Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 och Std5.

3). I röret märkt Std0, tillsätt 90 μL DNA-spädningsbuffert och 10 μL HEK293 DNA Control för att uppnå en koncentration på 3 ng/μL. Vortexa försiktigt för att blanda och centrifugera kort (10 sekunder). Denna koncentration kan alikvoteras och förvaras vid -20°C för kortvarig användning (upp till 3 månader). Undvik upprepade frys-upptiningscykler.

4). I rören märkta Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 och Std5, tillsätt först 90 μL DNA-spädningsbuffert till varje. Varje spädningssteg ska blandas försiktigt och centrifugeras kort för att säkerställa enhetlighet. Utför sedan gradient spädningar enligt följande:

Tabell 1: Standardgradientspädning

* För varje koncentration, utför 3 replikat. Detta reagens kan testas inom ett linjärt område på 300 pg/μL till 30 fg/μL. Om det behövs kan det linjära området utökas eller minskas på lämpligt sätt.

** För att minska upprepade frys-upptiningscykler och undvika kontaminering, rekommenderas att alikvotera och lagra DNA-kvantifieringen standard vid -20°C för första användningen.

*** Oanvänd, tinad DNA-spädning kan förvaras vid 2-8°C i upp till 7 dagar. Om den inte används under en längre tid, förvara den vid -20°C.

**** För att säkerställa fullständig blandning av mallen, skaka varje gradientspädning försiktigt i cirka 1 minut.

2. Beredning av testprov (TS)

Förbered testprovet TS enligt experimentuppställningen, enligt följande:

1) Ta 100 μL av testprovet och tillsätt det till ett 1,5 mL rent centrifugrör. Märk det som TS, utför provförbehandling och förbered to purify den testprov.

2) För att uppfylla kravet på att analysera fyra olika förlängningslängder samtidigt, bör mängden förbehandlat testprov vara ≥120 μL. Därför rekommenderas det att förbereda 2 rör av varje prov för förbehandling, och efter extraktion, blanda ihop dem för användning.

3. Förberedelse av negativ extraktionskontroll (NCS)

Förbered den negativa extraktionskontrollen NCS enligt experimentuppställningen, enligt följande:

1) Ta 100 μL av provmatrislösningen (eller DNA-spädning buffert) och tillsätt den till ett 1,5 ml rent centrifugrör. Märk det som NCS.

2) Utför provförbehandlingen av den negativa kontroll-NCS tillsammans med satsen av testprover och förbered den renade negativa kontroll-NCS-lösningen.

3) För att uppfylla kravet på att analysera fyra olika förlängningslängder samtidigt bör mängden förbehandlat NCS-prov vara ≥120 μL. Därför rekommenderas det att förbereda 2 rör av varje NCS-prov för förbehandling och efter extraktion blanda dem för användning.

4. Förberedelse av ingen mallkontroll (NTC)

Förbered NTC för kontroll utan mall enligt experimentinställningen, enligt följande:

1) Ingen mallkontroll (NTC) kräver inget prov förbehandling, och kan framställas med början från steget att detektera kvarvarande DNA-innehåll med hjälp av qPCR.

2) För varje rör eller brunn består NTC-provet av 20 μL blandning (dvs. 15 μL HEK293 qPCR Mix + 5 μL motsvarande HEK293 Primer & Probe Mix) + 10 μL DNA-spädningsbuffert. Det rekommenderas att förbereda tillräckligt för 3 replikatbrunnar.

5. qPCR-reaktionssystem

Tabell 2. Reaktionssystem för 82 bp fragment

Tabell 3. Reaktionssystem för 133 bp-fragment

Tabell 4. Reaktionssystem för 227 bp-fragment

Tabell 5. Reaktionssystem för 515 bp-fragment

* För att beräkna den totala mängden Mix som krävs för denna reaktion baserat på antalet brunnar:

Blanda = (Antal reaktionsbrunnar + 2) × (15 + 5) μL (för att ta hänsyn till de 2 brunnarnas förlust). Vanligtvis prepareras 3 replikatbrunnar för varje prov.

** Antal reaktionsbrunnar = (5 brunnar med standardkurv för koncentrationsgradient + 1 ingen mallkontroll (NTC) + 1 negativ kontrolllösning (NCS) + N testprov (TS)) × 3.

NTC (ingen mallkontroll): DNA-spädningsbuffert

NCS (negativ kontrolllösning): Provmatrislösning eller DNA-spädningsbuffert efter prov för-behandling för att erhålla den renade lösningen, som är NCS.

TS (Test Sample): Provet som ska testas.

*** Efter att ha dispenserat proverna och förseglat rören, centrifugera kort med låg hastighet (10 sek) för att samla upp vätskan från rörväggarna till botten. Vortexa sedan i minst 5 sekunder för att blanda ordentligt. Utför sedan ytterligare en låghastighetscentrifugering (10 sek). Om det finns några bubblor, se till att ta bort dem.

Tabell 6: Referensplattans layout

Detta exempel visas qPCR-detektionsproceduren för att analysera amplifieringsfragmenten av kvarvarande HEK293-DNA.Testproverna inkluderar: 5 koncentrationsgradienter av HEK293 DNA-standardkurva, 1 testprov (TS), 1 negativ kontrolllösning (NCS) och 1 kontroll utan mall (NTC). Det rekommenderas att köra 3 replikatbrunnar för varje prov.

6. Amplifieringsprogramparametrar (Ttre-stegsmetod) (Exempel med användning av ABI 7500 qPCR-instrument, mjukvaruversion 2.0)**

1) Skapa ett nytt tomt program och välj "Absolut kvantifiering" som detektionsmall.

2) För de fyra olika amplifieringsfragmentlängderna, skapa nya detektionsprober och döp dem till "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227", och "HEK293-515". Välj reporterfluoroforen som "FAM" och quencherfluoroforen som "ingen". Ställ in referensfärgämnet för detektion som "ROX" (referensfärgämnet kan tillsättas eller inte beroende på instrumentmodell och andra faktorer).

3) I panelen "Tilldela mål till valda brunnar", ställ in "Task"-fältet för standardkurvbrunnarna som "Standard" och tilldela motsvarande värden i "Quantity"-fältet som "300000", "30000", "3000", "300", "30" (representerar DNA-koncentrationen per brunn, i fg/μL). Namnge brunnarna i fältet "Sample Name" som "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". För NTC-brunnarna, ställ in "Task" till "NTC". För NCS- och TS-brunnarna, ställ in "Task" till "Okänt" och namnge brunnarna "NCS" och "TS" i fältet "Sample Name". Efter att ha ställt in dessa parametrar, klicka på "Start Run" för att påbörja instrumentkörningen.

4) Amplifieringsprograminställningar: Ställ in trestegsförstärkningsprogrammet, med en reaktionsvolym på 30 μL.

Tabell7. PCR-förfarande

7. qPCR-resultatanalys

1) I "Analys"-panelen under "Amplification Plot" kommer systemet automatiskt att ställa in "Threshold". Ibland är standard "Threshold" för nära baslinjen, vilket orsakar betydande Ct-variationer mellan replikat. Du kan manuellt justera "Tröskeln" till en lämplig position och klicka på "Analysera". Vid denna tidpunkt kan du preliminärt kontrollera amplifieringskurvorna i "Multicomponent Plot" för att se om de är normala.

2) I "Analys"-panelen under "Standardkurva" kan du läsa standardkurvans R², förstärkningseffektivitet (Eff%), lutning och intercept. För en normal standardkurva: R² > 0,99, amplifieringseffektivitet (90% ≤ Eff% ≤ 110%) och lutning mellan -3,6 och -3,1.

3) I "Analys"-panelen under "View well table" kan du läsa kolumnen "Quantity" för no-template control (NTC), negativ kontroll (NCS) och testprover (TS), med enheten i fg/μL. Enheterna kan konverteras senare i rapporten.

4) Parameterinställningarna för resultatanalys bör bero på den specifika instrumentmodellen och mjukvaruversionen. Vanligtvis kan instrumentet automatiskt tolka resultaten.

5) Ct-värdet för den negativa kontrollen (NCS) bör vara större än det genomsnittliga Ct-värdet för standardkurvans lägsta koncentration.

6) Resultatet av no-template-kontrollen (NTC) bör vara "Obestämd" eller ha ett Ct-värde ≥ 32.

Dokumentera

Manuell