I. หลักการของเวสเทิร์นบล็อต
Western Blot (WB) หรือการทำโปรตีนอิบโนโมบิลล็อตติ้ง เป็นเทคนิคคลาสสิกในการตรวจหาโปรตีนเฉพาะโดยอาศัยปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาโมเลกุล ภูมิคุ้มกันวิทยา และสาขาที่เกี่ยวข้อง ขั้นตอนหลัก ได้แก่:
- การแยกโปรตีน-
- SDS-PAGE แยกโปรตีนที่ถูกทำลายสภาพตามน้ำหนักโมเลกุล
- SDS เคลือบโปรตีนด้วยประจุลบสม่ำเสมอ โดยกำจัดอิทธิพลของโครงสร้าง
- การถ่ายโอนเมมเบรน-
- โปรตีนจะถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังเมมเบรน (เช่น PVDF หรือไนโตรเซลลูโลส)
- การตรวจหาแอนติบอดี-
- แอนติบอดีปฐมภูมิจะจับกับโปรตีนเป้าหมายโดยเฉพาะ ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่จับกับเอนไซม์ (เช่น HRP) ซึ่งสร้างสัญญาณที่ตรวจจับได้ เช่น การเรืองแสงทางเคมี
II. เวิร์กโฟลว์เวสเทิร์นบล็อตมาตรฐาน
| ขั้นตอน | ขั้นตอนสำคัญ | สารเคมีที่แนะนำ - |
| 1. การเตรียมตัวอย่าง | สกัดโปรตีนด้วยบัฟเฟอร์ไลซิส RIPA เติม PMSF เพื่อยับยั้งโปรตีเอส กิจกรรม- | บัฟเฟอร์ไลซิส RIPA รุ่น PMSF |
| 2. การวัดปริมาณโปรตีน | ใช้หลักการ BCA (แมว#20200ES) เพื่อการวัดปริมาณ ให้จับคู่บัฟเฟอร์เจือจางมาตรฐานกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง | ชุดตรวจวัดปริมาณ BCA (แมว#20200ES-20201ES- |
| 3. การวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟรีซิสด้วย SDS-PAGE | ใช้เจลหล่อสำเร็จ ทำงานที่ 150 V จนกว่าสีจะถึงก้นเจล | เจลสำเร็จรูป, บัฟเฟอร์โหลด SDS-PAGE |
| 4. การถ่ายโอนและการบล็อกเมมเบรน | กระตุ้นเมมเบรน PVDF (หมายเลขแมว36125ES- โดยแช่ในเมทานอลเป็นเวลา 1 นาที ถ่ายเทที่ 300 mA เป็นเวลา 60 นาทีในน้ำแข็ง ปิดกั้นที่อุณหภูมิห้อง (RT) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หรือใช้สารละลายปิดกั้นอย่างรวดเร็ว (แมว#36122ES) เป็นเวลา 10 นาที | ทรบัฟเฟอร์ ansfer ซีรีส์เมมเบรน PVDF |
| 5. การฟักตัวของแอนติบอดี | ฟักกับแอนติบอดีปฐมภูมิที่อุณหภูมิ 4°C ค้างคืน ฟักกับแอนติบอดีทุติยภูมิที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1-2 ชั่วโมง ล้างด้วย TBST 3x ให้สะอาด | สารละลายแอนติบอดี |
| 6.การตรวจจับโปรตีน | พัฒนาด้วย ECL (แมว#36208ES- | ซีรีย์เคมีเรืองแสง ECL |
รูปที่ 1: เวิร์กโฟลว์เวสเทิร์นบล็อต
III. ปัญหาทั่วไปและแนวทางแก้ไข
| ปัญหา | สาเหตุที่เป็นไปได้ | โซลูชั่น |
| พื้นหลังสูง  | การบล็อคไม่สมบูรณ์ | ใช้สารละลายบล็อคสดและขยายเวลาการบล็อค- |
| การซักที่ไม่เพียงพอ | เพิ่มความถี่และระยะเวลาในการซักเพื่อขจัดการยึดเกาะที่ไม่เฉพาะเจาะจง | |
| ความเข้มข้นของแอนติบอดีปฐมภูมิมากเกินไป | เจือจางแอนติบอดีให้มีความเข้มข้นที่เหมาะสม | |
| ตัวอย่างปัญหาด้านคุณภาพ | ตรวจสอบความบริสุทธิ์และคุณภาพของตัวอย่าง ใช้ตัวอย่างที่สดใหม่ | |
| การอบแห้งเมมเบรน | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเมมเบรนยังคงชุ่มชื้นในระหว่างขั้นตอนการฟัก และให้แน่ใจว่าสัมผัสกับสารละลายปฏิกิริยาอย่างสมบูรณ์ | |
| สัญญาณอ่อนหรือไม่มีสัญญาณ  | โอนไม่ครบ | ตรวจสอบประสิทธิภาพการถ่ายโอนและปรับเวลาตามความจำเป็น |
| เมมเบรน PVDF ที่ไม่ได้ใช้งาน | แช่ PVDF ในเมทานอลเพื่อเปิดใช้งานก่อนที่จะถ่ายโอนไปยังบัฟเฟอร์ | |
| ความไม่ตรงกันของแอนติบอดีหลักกับสายพันธุ์เป้าหมาย | ตรวจสอบแผ่นข้อมูล เปรียบเทียบลำดับอิมมูโนเจนและโปรตีน และรวม การควบคุมเชิงบวกที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย (เช่น β-แอกตินในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) | |
| ความไม่เข้ากันของแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิ | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าแอนติบอดีรองตรงกับชนิดโฮสต์ของแอนติบอดีหลัก | |
| การจับแอนติบอดีไม่เพียงพอ | เพิ่มความเข้มข้นของแอนติบอดีและขยายเวลาฟักที่อุณหภูมิ 4°C (เช่น ข้ามคืน) | |
| ระดับแอนติเจนต่ำ | โหลดโปรตีนอย่างน้อย 20-30 μg ต่อเลน ใช้สารยับยั้งโปรตีเอสและการควบคุมเชิงบวก | |
| การแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายต่ำ | ยืนยันการแสดงออกในตัวอย่างผ่านทางเอกสาร/ฐานข้อมูล เน้นตัวอย่างหรือใช้การควบคุมการแสดงออกสูง | |
| แบนด์ไม่เฉพาะเจาะจง/หลายแบนด์  | เซลล์ที่ผ่านการถ่ายทอดทางพันธุกรรมทำให้โปรไฟล์โปรตีนเปลี่ยนแปลงไป | ใช้เซลล์ที่มีช่วงผ่านต่ำ (<15 ช่วง) และรันการควบคุมแบบคู่ขนานกับสต็อกที่มีช่วงผ่านเร็ว |
| การย่อยสลายโปรตีน | ใส่สารยับยั้งโปรตีเอสในบัฟเฟอร์ไลซิส เก็บที่อุณหภูมิ -80°C หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลาย ให้ใช้ตัวอย่างที่สดใหม่ | |
| การดัดแปลงหลังการแปล | ตรวจสอบเอกสารเกี่ยวกับการดัดแปลงที่ส่งผลต่อขนาดแบนด์ (เช่น ยูบิควิติเนชัน ไกลโคซิเลชัน) | |
| มีตัวเลือกการเชื่อมต่อหลายแบบ | ตรวจสอบรูปแบบการต่อกันผ่านทางเอกสารหรือฐานข้อมูล | |
| โปรตีนไดเมอร์/มัลติเมอร์ | เติม β-เมอร์แคปโตเอธานอลหรือ DTT ใหม่ลงในบัฟเฟอร์โหลด SDS | |
| การปนเปื้อนของโปรตีนจากภายนอก | ตรวจสอบโปรตีนจากภายนอก สลับสายเซลล์หากจำเป็น | |
| การโหลดตัวอย่างมากเกินไป | เพิ่มประสิทธิภาพการโหลด (20-30 μg) ตามการแสดงออกเป้าหมายผ่านการทดสอบการไล่ระดับ | |
| การก่อตัวของมัลติเมอร์ | ต้มตัวอย่างเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อแยกมัลติเมอร์ออกจากกัน | |
| ความเข้มข้นของแอนติบอดีปฐมภูมิสูง | ลดความเข้มข้นและ/หรือเวลาฟักเพื่อหลีกเลี่ยงแถบพิเศษ | |
| ความเข้มข้นของแอนติบอดีรองสูง | ความเข้มข้นที่ต่ำลงและรวมการควบคุมรองเพียงอย่างเดียวเพื่อลดการจับแบบไม่จำเพาะ | |
| การตรวจจับโปรตีนหรือสมาชิกในครอบครัวที่ไม่ได้รายงาน | ทบทวนวรรณกรรมหรือ BLAST ใช้เซลล์/เนื้อเยื่อที่แนะนำ | |
| หากได้รับการยืนยันแล้ว คุณอาจค้นพบโปรตีนชนิดใหม่! | ||
| วงดนตรียิ้ม  | การโยกย้ายที่รวดเร็ว อุณหภูมิบัฟเฟอร์สูง การโอเวอร์โหลด บัฟเฟอร์ต่ำ | การโยกย้ายช้า บัฟเฟอร์ที่เย็นล่วงหน้า ลดภาระโปรตีน ให้แน่ใจว่าบัฟเฟอร์ครอบคลุมหลุมอย่างเต็มที่ |
| วงขมวดคิ้ว  | ปัญหาอุปกรณ์ (เช่น ฟองอากาศใต้เจล) | ปรับการตั้งค่าเพื่อกำจัดฟองอากาศและให้แน่ใจว่าเกิดการโพลีเมอไรเซชันของเจลอย่างทั่วถึง |
| แถบหาง  | ตัวอย่างมีความสามารถในการละลายต่ำ ย่อยสลาย บัฟเฟอร์ถูกนำกลับมาใช้ใหม่ | ผสมตัวอย่างให้เข้ากัน ใช้ตัวอย่างสด เตรียมบัฟเฟอร์วิ่งที่สดใหม่ |
| แถบรูปดัมเบล  | เจลไม่เรียบ การเกิดพอลิเมอร์, ตัวอย่างที่ไม่บริสุทธิ์ | หล่อเจลใหม่เพื่อความสม่ำเสมอ ปั่นตัวอย่างก่อนใช้งาน |
| การทาแถบ  | โหลดมากเกินไป คุณภาพเจลไม่ดี | ลดปริมาตรตัวอย่าง ปรับปรุงการเตรียมเจล |
| รอยฟองสบู่  | อากาศติดอยู่ระหว่างการถ่ายโอน | เอาฟองอากาศออกเมื่อประกอบแซนวิชการถ่ายโอน |
| จุดดำไม่สม่ำเสมอ  | สารละลายบล็อคที่ไม่ละลาย การกระจายแอนติบอดีไม่สม่ำเสมอ | ละลายสารละลายที่ปิดกั้นให้หมด ล้างด้วย TBST 3 ครั้ง เขย่าระหว่างการฟัก |
| จุดขาว  | ความเข้มข้นของแอนติบอดีสูงทำให้สารตั้งต้นลดลง | ลดความเข้มข้นของแอนติบอดีปฐมภูมิ/ทุติยภูมิ |
Ⅳ.เครื่องมือการเลือกและเพิ่มประสิทธิภาพผลิตภัณฑ์
สินค้าที่เกี่ยวข้อง:
| ขั้นตอนการดำเนินการ | หมายเลขแคท | ชื่อสินค้า | ข้อมูลจำเพาะ |
| การเตรียมตัวอย่าง | 20101ES | บัฟเฟอร์ไลซิส RIPA (เข้มข้น) | 100 มล. |
| 20115ES | RIPA Lysis Buffer (ขนาดกลาง) | 100 มล. | |
| 20114ES | บัฟเฟอร์ไลซิส RIPA (อ่อน) | 100 มล. | |
| 20118ES | บัฟเฟอร์ไลซิสสำหรับการทดสอบ WB/IP | 100 มล. | |
| ชุดตรวจวัดปริมาณโปรตีน BCA (ขั้นสูง) | 500ตัน/2500ตัน/5000ตัน | ||
| ชุดตรวจวัดปริมาณโปรตีน BCA (พร้อมใช้งาน) | 500 ตัน | ||
| การวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟรีซิส SDS-PAGE | โกลด์แบนด์พลัส โปรตีนมาร์กเกอร์ 3 สี ช่วงปกติ (8-180 kDa) | 250 ไมโครลิตร/2×250 ไมโครลิตร/10×250 ไมโครลิตร | |
| เครื่องหมายโปรตีน GoldBand™ 3 สีช่วงสูง (10-245 KDa) | 2×250 ไมโครลิตร/10×250 ไมโครลิตร | ||
| 20328ES | ชุดเตรียมเจล SDS-PAGE | 1 ชุด (30~50 เจล)/ 1 ชุด (150~250 เจล) | |
| PAGE Gel ชุดเตรียมอาหารด่วน | ความเข้มข้น: 8%、10%、12.5%、15% | ||
| 36259ES-36280ES | พรีคาสท์ โปรตีน พลัส เจล | ความเข้มข้น: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% ตัวเลือกการโหลดบ่อน้ำ: 10 บ่อ、12 บ่อ、15 บ่อ | |
|
การถ่ายโอนและการบล็อกเมมเบรน | เมมเบรน PVDF 0.45 μm (1 ม้วน 30ซม.×3ม.) | 1 ม้วน | |
| เมมเบรน PVDF 0.22 μm (1 ม้วน 30ซม.×3ม.) | 1 ม้วน | ||
| การฟักตัวแอนติบอดี | 36206ES | สารเจือจางแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิสำหรับ WB | 100มล./500มล. |
|
การตรวจจับโปรตีน | น้ำยาตรวจจับ Super ECL | 100มล./500มล. | |
| ชุดสารตั้งต้นเรืองแสงเคมี ECL ที่ได้รับการปรับปรุง | 100มล./500มล. |
วี.วิธีการรับการสนับสนุน
สำหรับการแก้ไขปัญหาเฉพาะบุคคลหรือการเพิ่มประสิทธิภาพโปรโตคอล:
- เยี่ยม:
Yeasen หน้าผลิตภัณฑ์เวสเทิร์นบล็อต - อีเมล: info@yeasenbio.com
กฎทองแห่งความสำเร็จ: ขั้นตอนมาตรฐาน + สารเคมีคุณภาพสูง + การตรวจสอบทีละขั้นตอน = ผลลัพธ์ WB ที่ทำซ้ำได้!