1. Lời nói đầu
Đại thực bào là các tế bào thực bào lớn biệt hóa từ các tế bào đơn nhân trong máu. Chúng có mặt trong hầu hết các mô, đặc biệt là những mô thường xuyên tiếp xúc với thế giới bên ngoài như da, phổi và ruột. Đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như hệ thống miễn dịch của con người, phản ứng viêm, sửa chữa mô, điều hòa miễn dịch và phát triển bệnh.
Đại thực bào nguyên phát của con người khó phân lập từ các mô với số lượng đủ lớn và không tăng sinh trong nuôi cấy. Đại thực bào có nguồn gốc từ tế bào đơn nhân cung cấp một giải pháp thay thế tuyệt vời vì tế bào đơn nhân trong máu người dễ dàng thu được với số lượng lớn và có thể biệt hóa thành đại thực bào trong ống nghiệm.
2.Chức năng sinh học của đại thực bào
- Thực bào
Đại thực bào nhận biết và nuốt các tác nhân gây bệnh và mảnh vụn tế bào chết thông qua các thụ thể trên bề mặt của chúng. Quá trình này không chỉ giúp loại bỏ nhiễm trùng mà còn ngăn ngừa các chất này tích tụ trong cơ thể, có thể gây viêm hoặc các vấn đề khác.
- Phòng thủ chống lại mầm bệnh
Đại thực bào chống lại tác nhân gây bệnh bằng cách sản xuất ra các chất hóa học tiêu diệt vi sinh vật, chẳng hạn như oxy phản ứng và oxit nitơ, cũng như cytokine và chemokine điều chỉnh phản ứng viêm.
- Điều hòa viêm
Đại thực bào đóng vai trò phức tạp trong phản ứng viêm. Chúng không chỉ có thể thúc đẩy tình trạng viêm bằng cách giải phóng các cytokine tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và interleukin 1 (IL-1), mà còn ức chế tình trạng viêm bằng cách sản xuất các cytokine chống viêm như IL-10 và TGF-β.
- Sửa chữa và tái tạo mô
Sau phản ứng viêm, đại thực bào giúp sửa chữa và tái tạo mô bằng cách tiết ra nhiều yếu tố tăng trưởng khác nhau. Chúng loại bỏ phần còn lại của tổn thương đồng thời thúc đẩy sự hình thành các mô mới.
- Điều hòa miễn dịch
Đại thực bào thúc đẩy phản ứng miễn dịch đặc hiệu bằng cách trình bày kháng nguyên cho tế bào T. Đồng thời, chúng điều chỉnh các thành phần khác của hệ thống miễn dịch bằng cách tiết ra nhiều loại cytokine, chẳng hạn như điều chỉnh hoạt động của tế bào T và tế bào B.
- Mối quan hệ với bệnh tật
Đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của nhiều bệnh, bao gồm bệnh truyền nhiễm, bệnh tự miễn, khối u và bệnh viêm mãn tính như xơ vữa động mạch.
3. Phân loại đại thực bào
Theo trạng thái hoạt hóa và chức năng của chúng, đại thực bào có thể được chia thành hai loại chính: M1 và M2. Hai phân nhóm này đóng vai trò khác nhau trong phản ứng miễn dịch và điều hòa viêm.
Đại thực bào M1
Đại thực bào M1 chủ yếu được kích thích bởi các cytokine như interferon gamma (IFN-γ) và yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α), và có đặc tính gây viêm. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, có thể sản sinh ra các gốc tự do oxy và các yếu tố gây viêm, và tham gia vào việc tiêu diệt và thanh lọc các vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn và vi-rút.
Đại thực bào M1 tham gia vào hệ thống miễn dịch và phản ứng viêm của cơ thể, thúc đẩy sự xâm nhập của các tế bào viêm và miễn dịch, hỗ trợ loại bỏ các mô bị nhiễm trùng và bị tổn thương, đồng thời thúc đẩy sự xuất hiện và duy trì các phản ứng viêm miễn dịch.
Đại thực bào M2
Đại thực bào M2 chủ yếu được kích thích bởi các cytokine như interleukin-4 (IL-4) và interleukin-13 (IL-13), và có đặc tính chống viêm và sửa chữa. Chúng tham gia vào quá trình sửa chữa và tái tạo mô, thúc đẩy phản ứng chống viêm và điều hòa miễn dịch.
Đại thực bào M2 đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn cuối của quá trình viêm và sửa chữa mô, thúc đẩy quá trình giải quyết tình trạng viêm và sửa chữa mô, điều chỉnh sự cân bằng của phản ứng miễn dịch và thúc đẩy quá trình tái tạo và sửa chữa mô.
Hình 1. Tóm tắt các trạng thái phân cực đại thực bào chính của đại thực bào được kích hoạt [1]
4. Phân lập, nuôi cấy và phân biệt đại thực bào trong ống nghiệm
4.1 Phương pháp tách
- Phân lập từ máu ngoại vi
Phân lập các tế bào đơn nhân: Các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được phân lập bằng cách sử dụng phương pháp ly tâm mật độ gradient (ví dụ, Ficoll-Paque). Mẫu máu được thêm vào lớp trên cùng của Ficoll, và sau khi ly tâm, các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp huyết tương và lớp Ficoll.
Phân lập đại thực bào: Sau khi các tế bào đơn nhân được phân lập từ PBMC, các tế bào tiền thân đơn nhân có thể được phân lập thêm bằng phương pháp bám dính nhựa. Các tế bào đơn nhân được nuôi cấy trong các đĩa nuôi cấy nhựa trong vài giờ, các tế bào không bám dính được loại bỏ và các tế bào bám dính còn lại chủ yếu là các tế bào tiền thân đơn nhân.
- Tách khỏi mô
Các mẫu mô được chia nhỏ thành các hỗn dịch tế bào đơn lẻ bằng phương pháp xử lý cơ học và/hoặc bằng enzym (ví dụ, collagenase và DNase). Các tế bào không phải mục tiêu được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm theo mật độ hoặc chọn lọc âm tính (sử dụng kháng thể và hạt từ) và các đại thực bào được thu thập.
4.2 Phương pháp nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thường được sử dụng bao gồm RPMI 1640 hoặc IMDM, thường cần bổ sung 10% huyết thanh bò thai nhi (FBS), 1% penicillin/streptomycin và các yếu tố tăng trưởng cần thiết. Điều kiện nuôi cấy thường là trong lồng ấp ở 37°C và 5% CO2
4.3 Phương pháp cảm ứng phân biệt
- Sự phân biệt từ các tế bào tiền thân đơn nhân
Sử dụng M-CSF: Thêm yếu tố kích thích tạo khuẩn lạc đại thực bào (M-CSF) vào môi trường nuôi cấy, thường ở nồng độ 20-50 ng/mL, và tiếp tục nuôi cấy trong 7-10 ngày để thúc đẩy quá trình biệt hóa tế bào tiền thân đơn nhân thành đại thực bào.
Sử dụng GM-CSF: Yếu tố kích thích khuẩn lạc bạch cầu hạt-đại thực bào (GM-CSF) cũng có thể thúc đẩy sự biệt hóa của đại thực bào, đặc biệt là xu hướng sản xuất đại thực bào M1 (tiền viêm).
- Điều chỉnh thêm kiểu hình và chức năng
Đại thực bào M1: có thể được tạo ra bằng cách thêm IFN-γ (interferon-γ) và LPS (lipopolysaccharide) vào môi trường nuôi cấy.
Đại thực bào M2: có thể được tạo ra bằng cách bổ sung các cytokine chống viêm như IL-4 và IL-13.
Các phương pháp này cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu các chức năng sinh học khác nhau của đại thực bào và hành vi của chúng trong điều kiện bệnh lý trong ống nghiệm. Các điều kiện hoạt động cụ thể của từng bước (như mật độ tế bào, thời gian nuôi cấy, nồng độ các yếu tố bổ sung, v.v.) có thể cần được tối ưu hóa theo mục đích cụ thể của thí nghiệm.
Bảng 1.Nuôi cấy đại thực bào và điều kiện cảm ứng
| Nguồn tế bào | Môi trường nuôi cấy | Bổ sung ban đầu | Phân cực M1 | Phân cực M2 |
| Tế bào THP-1 | RPMI 1640 | PMA 100 ng/mL | 20 ng/mL IFN-γ 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL IL-4 20 ng/mL IL-13 |
| Bạch cầu đơn nhân | RPMI 1640 | M1:50 ng/mL GM-CSF M2: 50 ng/mL M-CSF | 10 ng/mL LPS 50 ng/mL IFN-γ | M2a: 20 ng/mL IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/mL TGF-β1 hoặc 10 ng/mL IL-10 |
| Tôimũi tên | IMDM | 10-50 ng/mL M-CSF | 100 ng/mL LPS (Có thể thêm 50ng/mL IFN-γ) | 10 ng/mL IL-4 (Có thể thêm 10 ng/mL IL-13) |
| RAW264.7 Tế bào | DMEM | / | 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL IL-4 (có thể thêm 20 ng/mL IL-10) |
5. Dữ liệu thử nghiệm
Cytokine hoạt động mạnh HiActive®：Hoạt động sinh học của từng cytokine đã được xác minh để đảm bảo hoạt động cao của cytokine.
Dữ liệu xác minh hoạt động:
Protein M-CSF chuột tái tổ hợp
Nhân vật 1. Được đo trong xét nghiệm tăng sinh tế bào sử dụng chuột M‑NFS‑60 tế bào lymphoblast bệnh bạch cầu tủy. ED50 cho tác dụng này thường là 16,74 -25,83 ng/ml.
tái tổ hợp Chuột GM-CSF Chất đạm
Nhân vật 2. ED50 được xác định bằng xét nghiệm tăng sinh tế bào sử dụng tế bào FDC-P1 ở chuột là 2,79-12,84 pg/mL.
tái tổ hợp IL-10 của con người Chất đạm
Nhân vật 3. ED50 được xác định bằng xét nghiệm tăng sinh tế bào sử dụng tế bào MC/9 ở chuột nhỏ hơn 0,1 ng/mL, tương ứng với hoạt động đặc hiệu > 1,0×107 Đơn vị/mg.
Sản phẩm liên quan
| Phân loại | Giống loài | Con mèo | Đặc điểm kỹ thuật |
| G-CSF | Nhân loại | 2 μg/10 μg/ 50 μg/ 100 μg | |
| Chuột | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | Nhân loại | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Chuột | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
GM-CSF | Nhân loại | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Chuột | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | Nhân loại | 20 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Chuột | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-4 | Nhân loại | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Chuột | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Nhân loại | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Chuột | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Nhân loại | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Chuột | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Tài liệu tham khảo
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Vai trò của sự phân cực đại thực bào ở người trong tình trạng viêm trong các bệnh truyền nhiễm. Int J Mol Sci. 2018 ngày 19 tháng 6;19(6):1801.