什么是二抗?
二抗是能与一抗结合的抗体,主要用于检测一抗的存在。一抗特异性地与抗原结合,二抗特异性地与一抗结合。也就是说,一抗的Fc区或Fab片段可以作为抗原刺激机体产生抗体。也就是说,一抗主要是IgG类免疫球蛋白,所以二抗是抗IgG的抗体。
二抗的作用
一抗是特异性地与目标蛋白结合的,一抗需要标记发光物质或显色基团,用肉眼是无法看出一抗是否 绑定 蛋白。但是一抗相对特异性强,而且每只抗体都标记成本较高。常见的是使用标记的二抗,该二抗可以与一抗结合,并且带有可检测的标记(如荧光、放射性、化学发光或显色基团)。所以目前的设计一般是二抗带有可检测的标记来检测一抗,而一抗识别底物。这样当一抗与底物结合时,就可以通过二抗检测到。
例如ECL发光原理:在ECL底物中,有H2哦2 以及鲁米诺(及其衍生物),在HRP(辣根过氧化物酶)作用下发出荧光。
使用二抗的要点
二抗是用一抗种属(如兔、小鼠)的某一亚型的免疫球蛋白IgG免疫哺乳动物(通常免疫山羊、马、驴、骡和豚鼠等)产生的抗体,因此二抗只与一抗的特定种属和亚型结合。例如羊抗鼠(二抗)会特异性地与小鼠单克隆(一抗)结合,而不会与兔多克隆或大鼠单克隆结合。
二抗偶联标记
不同的实验方法会导致二抗所偶联基团不同,主要有酶(辣根过氧化物酶/HRP和碱性磷酸酶/AP)、荧光基团(FITC、Rhodamine、PE、Dylight、Alexa Fluor、cy3等)、生物素、金颗粒等。一般WB、ELISA、IHC等实验建议使用HRP标记的二抗,IHC建议使用生物素标记的二抗,而IF、FC等实验则使用荧光标记,如Alexa Fluor 488、FITC、PE等。
如何选择合适的二抗
免疫印迹法(WB)
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对于传统的Western印迹法,选择标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的二抗;对于荧光Western印迹法,选择标记有相应荧光团的二抗。
b.免疫组织化学(IHC/ICC)
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B. 对于 ICC(免疫细胞化学),选择用生物素标记的二抗。
C. 免疫荧光(IHF/ICF)
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免疫沉淀通常允许选择使用 Fc 或 Fab 特异性的二抗。此类二抗可以避免重链(分子量 55 kDa)或轻链(分子量 25 kDa)的干扰。
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绿色荧光 | 33106ES | YSFluor™ 488 山羊抗兔 IgG (H+L) |
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参考
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