1 遗传霉素的作用原理

基因霉素 (Geneticin, G418) 是一种氨基糖苷类抗生素，通过与原核和真核细胞中的 70S 和 80S 核糖体结合，阻止肽链延伸，从而抑制蛋白质合成。这种机制对细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等细胞具有毒性。当细胞成功转染并整合新霉素抗性基因（如 neo 基因）时，基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶 (APH (3) II) 可以共价修饰 G418 使其失活，从而赋予在含有 G418 的选择性培养基中生长的细胞抗性。

在分子遗传学检测中，G418是常用的稳定转染试剂之一。

2 基因霉素的应用

2.1 稳定转染细胞株的筛选

• G418用于筛选含有抗性基因（如neo基因）的细胞，通过抑制蛋白质合成，抗性基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶使G418失活，使细胞对G418产生抗性。通常，哺乳动物细胞的筛选范围为200 – 2000 μg/mL，最常用的工作浓度为100 – 700 μ g/mL。植物细胞为10-100 μg/mL，酵母细胞为500-1000 μ g/mL，以下是使用G418对某些细胞类型的使用浓度，供参考。

细胞	应用	基因霉素活化浓度(μg/mL)	参考文献
毛霉属	a) 在生长培养基中培养 b) 在冻干细菌上培养	a) 10 μg/毫升 b) 30 微克/毫升	Hirth 等人， 美国国家科学院院刊， 第 79 卷，7356-7360 页 (1982 年)。
哺乳类	a) 用于筛查 b) 为了保持增长	a)400 -1000 μg/mL b) 200 μg/毫升	迦南和伯格， 美国国家科学院院刊， 第79卷，5166-5170（1982年）。
植物	a) 用于筛查 b) 为了保持增长	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/毫升	Ursic 等人， 生物化学与生物物理研究通讯， v.101:3,1031-1037（1981）。
酵母	a) 用于筛查 b) 为了保持增长	a) 500 μg/毫升 b) 125-200 μg/毫升	希门尼斯和戴维斯， 自然， 第287卷，869-871（1980年）。
细菌	用于筛查	16微克/毫升	Waitz 等人， 抗微生物剂化疗， 第 6:5, 579-581 (1974)。

2.2 基因敲除与基因转移

• 在基因敲除中，G418可用于筛选成功敲除目的基因的细胞；在基因转移中，G418可促进外来基因整合到宿主细胞的基因组中。

2.3 细胞培养中的抗性选择

• 在细胞培养过程中，G418 用于筛选对抗生素有耐药性的细胞，这些细胞通常携带特定的耐药基因。

3 基因霉素相关实验步骤

3.1 制备G418储备溶液（50mg / mL，有效浓度）

1）活动单位的换算

使用公式进行转换：(1000/A0) × A1 = A2，其中 A0 是 G418 的效力，因批次而异。请参阅相应批次的质量控制报告或瓶子上的标签。A1 是要制备的 G418 的所需活性浓度。A2 是要称量的实际粉末体积浓度。

例如，如果该批次的G418效力为750 U / mg，并且您想要制备50 mg / mL的有效浓度，则实际要制备的粉末浓度为1000/750×50 mg / mL = 66.67 mg / mL。

若配制10 mL G418原液（有效浓度50 mg/mL），则需要666.7 mg粉末。

• 灭菌与储存

根据以上换算得到的实际粉末重量，加入10 mL无菌去离子水中，完全溶解。

首先，用 5 mL 无菌去离子水预湿 0.22 μm 注射器过滤器，去除所有水。然后使用此过滤器进行过滤以进行灭菌，并分装成小体积供一次性使用（例如 1 mL），并在 -20°C 下储存 1 年。

3.2 杀灭曲线的建立

1) 第一天：将未转化细胞以 20-25% 的细胞密度接种于适当的培养板中，并在 37°C、CO 条件下孵育过夜₂。

2）根据细胞类型在合适范围内设置浓度梯度，至少选择6个浓度（G418对分裂期细胞活性最强，因此应先将细胞培养一段时间后再加入G418），例如对于哺乳动物细胞，设置0、50、100、200、400、800、1000 μg/mL。

3)第二天：弃去旧培养基，换成新鲜配制的相应药物浓度的培养基，每个浓度重复培养三次。

4）每3-4天更换一次新鲜含药培养基。

5）每隔一定时间（如每2天）进行活细胞计数，确定阻止未转染细胞生长的合适浓度。选择在理想天数内（通常为7-10天）能够杀死大多数细胞的最低浓度作为稳定转染细胞系筛选的工作浓度。

3.3 稳定转染细胞的筛选

• 益生生物提供的G418遗传霉素（60220ES）效力≥720 U/mg、纯度~98%、批次稳定，价格接近其他公司G418产品的三分之一。
• 每3-4天更换一次含有药物的筛选培养基。
• 筛选 7 天后观察并评估细胞克隆（菌落）的形成。菌落可能需要一周或更长时间才能形成，具体取决于宿主细胞类型、转染和筛选效果。
• 挑取5~10个抗性克隆,转移至35mm细胞培养板中,用含药筛选培养基维持7天。
• 换成正常培养基培养后。

4 产品推荐

G418 遗传霉素 (60220ES) 提供 Yeasen Biotech 的功效为≥720 U/mg、纯度~98%、批次稳定，价格接近其他公司 G418 产品的三分之一。

规格	S*	T*	Yeasen	Yeasen 优势
含量（高效液相色谱法）	/	/	~98％	高纯度
效力 (单位/毫克)	≥720微克/毫克	707-721 微克/毫克	≥720微克/毫克	高效
价格(美元/5克)	~1000	~1000	~200	廉价

5 实验案例

在大肠杆菌中，G69和G99为两个不同批次；基因霉素浓度分别为8mg/L、12mg/L和16mg/L，有效最低浓度为16mg/L，完全抑制杂菌生长。