1. 什么是树突状细胞（DC）？
树突状细胞（DC）是人体最有效的抗原呈递细胞（APC），是唯一能够强效刺激幼稚T细胞增殖的APC，其他类型的APC（如单核细胞、巨噬细胞、B细胞等）只能刺激活化或记忆性T细胞，因此DC细胞是适应性T细胞免疫反应的启动者，在肿瘤免疫中发挥极其重要的作用。DC细胞表面高表达MHC-I和MHC-II类分子，具有特异性的表面标志，能够摄取、加工和刺激T细胞活化抗原，并最终决定T细胞的分化方向。
2. 直流电源
DC细胞在体内的存在量极小，直接从体内分离DC需要较长的时间，且细胞产量很低，大大限制了DC的研究和应用。然而，DC可以从不同组织中的DC前体细胞中分化诱导，如骨髓液中的前体细胞、外周血和脐带血中的单核细胞等。
对于人类来说，由于人的外周血获取最方便，且单核细胞数量最多，所以最常用的方法是从人外周血单核细胞(PBMC)诱导DC；对于小鼠来说，最常用的方法是从骨髓细胞诱导DC，即骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。
图1. 经典BMDC制备方法示意图
3. BMDC制备方法
制备小鼠BMDC的常用方法有：
3.1 经典BMDC培养方法-Inaba方法（改良）
3.2 BMDC的大规模制备——Sons法
3.3 BMDC的大规模制备——Lutz法
3.1 【经典BMDC培养方法】-Inaba法（改良）
【背景】
一个。 通过 Inaba 方法获得的 BMDC 数量为 5-7 x 106/老鼠;
b. 原始Inaba法仅采用GM-CSF诱导产生BMDC，虽然获得的BMDC在混合淋巴细胞反应中刺激能力强，但DC的成熟度不如GM-CSF+IL-4联合诱导，因此后续改良法常采用GM-CSF+IL-4联合诱导。
【栽培步骤】
3.1.1 获取小鼠骨髓细胞
1） 采用颈椎脱臼法杀死小鼠(6-10周龄)，手术切除所有股骨和胫骨，用剪刀和镊子尽可能去除骨骼周围的肌肉组织。
[笔记】不要损坏骨头。
2） 将骨骼移至超净台上，放入含有70%酒精的无菌培养皿中浸泡2-5分钟，消毒灭菌，再用无菌PBS清洗两次。
3） 将骨移至另一新的含有PBS的培养皿中，用剪刀剪断骨的两端，再用注射器抽取PBS，将针头从骨的两端插入骨髓腔，反复将骨髓冲入培养皿，直至骨完全变白。
4） 收集骨髓悬液，用200目尼龙网滤除小碎片和肌肉组织。
5） 将滤液在 1200 度下离心 转速 5 分钟 弃上清液。
6） 加入2 ml氯化铵红细胞裂解缓冲液（1x），重悬细胞，室温下孵育3-5 分钟，最多 10 分钟
7） 加入 10 ml PBS 以中和裂解缓冲液的作用，然后以 1200 rpm 的速度离心 5 分钟 弃上清液。
8） PBS清洗一次，用含10％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，获得小鼠骨髓细胞。
氯化铵红细胞裂解液的制备：
一个。 制备 10x 储存溶液如下：称重 82.9 氨氮4氯气，10.0g KHCO3 和0.37g钠2EDTA，溶于1L蒸馏水，过滤，用0.22 μm滤膜除菌，4℃保存6个月；
b. 使用前，用无菌蒸馏水将10x储存溶液按1：9的比例稀释为1x工作溶液。
[笔记] 由于氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的损害作用，因此应尽可能缩短溶血时间。
3.1.2 诱导 BMDC 分化
1） 计数步骤1中获得的小鼠骨髓细胞，调整细胞浓度为0.5-1×106/ml含10％FBS的RPMI 1640完全培养基。
2） 将细胞接种于24孔培养板中，每孔1ml细胞，加入重组鼠GM-CSF（20 纳克/毫升) 和 IL-4 (10 纳克/毫升), 培养于37℃、5% CO2 孵化器。这是培养的第0天。
【笔记】
一个。 一般约4-5x107 可以从一只小鼠身上收获骨髓细胞，因此可以接种24孔板的至少40-50个孔。
b. GM-CSF和IL-4的浓度范围为20-50 纳克/毫升 和 10-40 纳克/毫升， 分别。
3） 每2天轻轻摇动培养板一次，然后用新鲜培养基替换3/4体积并补充细胞因子。
4） 在第5天和第8天之间，轻轻吹动培养基以收集悬浮细胞和松散附着的细胞。
5） 1200 度离心 转速 5 分钟 弃上清液。
6） 将细胞重悬于含10%FBS的RPMI 1640完全培养基中，计数，调整细胞浓度为1×106/ml，并加入重组小鼠GM-CSF（20 纳克/毫升) 和 IL-4 (10 纳克/毫升）。
7） 将细胞接种于 100 毫米培养皿（每皿最多 10 毫升）或 6 孔培养板（每孔 2 毫升）。
8） 继续在37℃、5% CO2 中培养2 孵化器内培养 1-2 天。
9） 收集悬浮细胞，这些细胞是更成熟的 BMDC。
【笔记】
一个。 步骤2.5-2.8为重新镀层步骤，目的是为了让步骤2.4中获得的BMDC更加成熟。
b. 重新铺板后3小时内可以看到很多带刺的贴壁细胞从DC簇中迁移出来，而培养1天后会发现这些贴壁细胞脱离培养板底部，可以看到很多典型的DC漂浮在培养基中。
3.1.3 BMDC 完全成熟
【注】步骤2中获得的BMDC还不是完全成熟的DC，如果想获得完全成熟的DC，还需经过LPS、CD40L或TNF-a诱导。
1） 将步骤 2.4 或 2.9 中获得的 BMDC 以 1200 的速度离心 转速 5 分钟 弃上清液。
2） 用含有重组小鼠 GM-CSF 的 RPMI 完全培养基 (20 纳克/毫升) 和 IL-4 (10 纳克/毫升), 并调整细胞浓度为1×106计数后为/ml。
3） 加入24孔培养板，并加入成熟诱导剂，如TNF-α（250 单位/毫升）、脂多糖（1 μg/mL) 或 CD40L (1 （微克/毫升）。
4） 培养于37℃、5% CO2 孵化器内培养 2 天。
5） 收集悬浮的细胞和松散地附着在壁上生长的细胞，这些细胞即为成熟的树突状细胞。
3.2【BMDC量产方法】-Son 方法
【背景】
一个。 该方法可得到30-40×106 7天内即可获得DC/鼠，是Inaba经典方法的7-10倍，DC经14.5%甲泛酸梯度离心后纯度（即CD11c+/I-Ab+细胞）可达85-95%。
b. 此方法获得的DC的内吞能力比Inaba经典方法弱，但分泌的IL-12p70的量相似。
c. 该方法获得的DC在混合淋巴细胞反应中刺激能力比Inaba经典方法更强。
d. 通过此方法获得的DC可以诱导更强的特异性T细胞应答。
e. 综上所述，Son方法比经典方法可以获得更多、更成熟的BMDC。
【栽培步骤】
3.2.1 获取小鼠骨髓细胞
参见 Inaba 方法（已修改）中的相应步骤。
3.2.2 大量BMDC的制备
1） 计数步骤1中获得的小鼠骨髓细胞，调整细胞浓度为2×105/ml含10%FBS的RPMI 1640完全培养基。
2） 接种于6孔培养板中，每孔5ml细胞，加入重组鼠GM-CSF（1000 单位/毫升)和IL-4(1000 单位/毫升), 培养于37℃、5% CO2 孵化器。
3） 培养第4天，向培养体系中补充重组鼠GM-CSF（1000 单位/毫升)和IL-4(1000 单位/毫升）。
4） 收集培养第 7 天的 DC，用 2-4 ml RPMI 1640完全培养基，加入等体积的14.5%（w/v）美帕内玛，室温离心20 最低 1200xg。
5） 收集中间层，用RPMI 1640完全培养基洗涤三次，备用。
[笔记] 此时的 DC 是未成熟的 BMDC。如果要进一步成熟，请跳至步骤 3。
3.2.3 BMDC 全面成熟
1） 将步骤 2.4 中收集的 BMDC 重新接种，并加入重组小鼠 GM-CSF (1000 单位/毫升)和IL-4(1000 单位/毫升)，以及LPS (1-10 微克/毫升）到文化系统
2） 培养于37℃、5% CO2 培养箱中培养2天即可获得成熟的BMDC。
3.3【BMDC批量制备方法】-Lutz方法
【背景】
一个。 Lutz法与Son法类似，两种方法都可以大量制备BMDC，但Lutz法比Son法应用更广泛。
b. 该方法可以获得更多BMDC，高达1-3 x 108 DC/mouse，纯度可达90-95%；
c. 该方法使用的细胞因子浓度比Son方法低得多，仅为200 单位/毫升，然后下降到30-100 单位/毫升 培养第8~10天，可大大节省试剂成本；
d. 该方法与Inaba经典方法及Son方法最大的不同在于，该方法将骨髓细胞培养在细菌培养皿（Petri dish）中，而非细胞培养板中。Inaba解释道，细菌培养皿不易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，避免巨噬细胞对DC成熟的抑制作用。这可能是该方法能在较低接种密度下获得大量BMDC的主要原因。
e. 但该方法培养时间较长，需要10-12天，一方面是为了获得更多的BMDC，另一方面大部分粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此无法提高最终获得的BMDC的纯度；
f. 该方法仅使用GM-CSF进行诱导培养，获得的BMDC既包含未成熟DC，又包含成熟DC，若要进一步提高成熟度，需再使用LPS或TNF-α诱导1-2天，成熟DC细胞含量将达到50-70%。
【栽培步骤】
3.3.1 获取小鼠骨髓细胞
参见Inaba方法（修改后）中相应步骤，注意应省略溶血步骤。
3.3.2 BMDC 的大规模制备
1） 计数步骤1中获得的小鼠骨髓细胞，调整细胞浓度为2×105/ml含10％FBS的RPMI 1640完全培养基；
2） 铺于100mm细菌培养皿（Petri Dish），每皿10ml细胞，加入重组鼠GM-CSF（200 单位/毫升），37℃、5％CO2培养箱培养；
[笔记] 这里使用的是细菌培养皿，而不是细胞培养板。
3） 第3天，加入10ml含有20 纳克/毫升 将重组鼠GM-CSF移至培养皿中；
4） 在第6天和第8天，更换一半培养基，即收集旧培养基，用含有20 纳克/毫升 离心后回收重组鼠GM-CSF，然后将细胞悬液放回原皿中；
5） 第十天即可收集细胞，即为BMDC。
3.3.3 BMDC 完全成熟
1） 培养第10天，用移液器轻轻吹打DC，收集悬浮细胞，室温300xg离心5分钟；
2） 弃上清，用10ml RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，然后铺于100mm细胞培养板上；
3） 添加重组小鼠 GM-CSF (100 单位/毫升) 和 TNF-α (500 单位/毫升)或重组小鼠GM-CSF(100 单位/毫升)和LPS(1 毫克/毫升）；
4） 继续在37℃、5% CO2 中培养2 孵化器内培养 1-2 天。
4. BMDC 的鉴定
升 形态学观察：BMDC多数呈集落状生长，细胞内有多个树突状突起，在成熟的BMDC中更为明显。
升 细胞表型分析：流式细胞仪检测DC细胞表面CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ类分子（IA/IE）的表达情况，BMDC高表达上述分子，在完全成熟的BMDC中上述分子的表达会进一步增多。
升 混合淋巴细胞反应（MLR）：BMDC具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
5. 如何选择成熟诱导剂？
LPS、CD40L和TNF-α是人DC和鼠DC常用且有效的成熟诱导剂。TNF-α诱导DC成熟的能力在三者中是最弱的。LPS和CD40L都是体外DC完全成熟的强诱导剂。两者诱导的DC成熟过程相似，但诱导的细胞因子谱不同。CD40L诱导成熟的BMDC在体内表现出最强的免疫调节能力，包括产生保护性和治疗性的肿瘤免疫反应。用LPS刺激DC完全成熟的浓度一般为1-10 μg/mL，但实际上0.1 μg/mL的效果已经非常强了，但为了保险起见，1 一般用μg/mL，需要注意的是CD40L分子属于TNF配体家族，特点是形成三聚体后才能发挥作用，所以最好用重组CD40L三聚体蛋白刺激DC，效果会很好，如果用CD40L单体刺激DC，多数情况下成熟度不是很高。
6. 训练方式的选择
表 1.三种制备BMDC的常见实验方法比较
| 范围 | 经典的BMDC培养方法-Inaba方法 | BMDC的大规模制备-Son法 | BMDC的大规模制备-Lutz法 |
| PubMed 中的引用次数 | 783 | 24 | 663 |
| 骨髓溶血、红细胞溶解 | 是的 | 是的 | 不 |
| 骨髓首先去除淋巴细胞 | 是的 | 不 | 不 |
| 培养过程中去除粒细胞 | 是的 | 不 | 不 |
| 骨髓细胞的初始接种体积 | 1毫升 | 15毫升 | 10毫升 |
| 孵化器 | 24 孔细胞培养板 | 6孔细胞培养板 | 100mm细菌培养皿 |
| 培养基 | RPMI1640+10% 胎牛血清 | ||
| 小鼠 GM-CSF 浓度 | 200-1000 单位/毫升 | 初始添加浓度为125-1000 单位/毫升 第4天和第7天向培养体系中加入足量的GM-CSF和IL-4。 | 初始添加浓度为200 单位/毫升。3-100 单位/毫升 第十天后 |
| 小鼠IL-4 | 不必 | 需要，浓度与GM-CSF相同 | 不必 |
| 液体交换法 | 第2天和第4天弃去50%～75%的旧培养基（其中含有细胞），换成含有足量GM-CSF的新鲜完全培养基。 | / | 第3天加入等体积的含GM-CSF的完全培养基，第6、8、10天更换一半培养基，吸出旧培养基（含细胞），离心，重悬于新鲜的含GM-CSF的完全培养基中，再放回。 |
| 传代前培养时间（扩增） | 6天 | 7 天 | 10 天 |
| 传代后培养时间（成熟） | 2 天 | 没有任何 | 1-2天 |
| 成熟诱导剂 | TNF-α（250 单位/毫升） | 脂多糖(1-10 微克/毫升） | TNF-α（250 单位/毫升）或 LPS(1 微克/毫升） |
| DC细胞采集时间 | 7-8天 | 7-8天 | 10-13天 |
| 直流纯度 | 第 8 天：60-70% | 第 7 天：85-95％ | 第 10-12 天：80-90％ |
| DC 生产/小鼠 | （5-7）×106 | （3-4）×107 | （1-3）×108 |
7. 推荐的DC培养试剂
| 产品名称 | 猫 | 尺寸 |
| 91108ES | 5 微克/50 微克/100 微克/500 微克 | |
| 90144ES | 5 微克/50 微克/100 微克/500 微克 | |
| 90621ES | 5 微克/20 微克/50 微克/500 微克 | |
| 94016ES | 二十五 微克/100 微克/500 微克 |