科学家们用什么酶来结合一个新基因呢？不用多说，DNA连接酶是其中之一。那么为什么DNA连接酶在重组DNA中如此重要呢？因为DNA连接酶负责将目标片段连接到载体上，这是决定实验成功的关键要素之一。作为DNA连接酶的一种，T4 DNA连接酶在分子克隆实验中起着什么作用？它是如何工作的？接下来将详细介绍T4 DNA连接酶。

1.什么是T4 DNA连接酶？
2. T4 DNA连接酶的作用是什么？
3. Yeasen Biotech T4 DNA 连接酶可用于 NGS 接头连接
4. 选择指南 Yeasen Biotech T4 DNA 连接酶

1.什么是T4 DNA连接酶？

T4 DNA连接酶是一种ATP依赖性连接酶，可催化DNA分子之间的连接反应。它主要通过连接3'-羟基和5'-磷酸端形成磷酸二酯。DNA连接酶参与所有生物体的DNA复制和修复过程。噬菌体编码的T4 DNA连接酶是在噬菌体T4感染大肠杆菌时产生的。
基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶，目前后者应用更为广泛。T4 DNA连接酶可以修复双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂交链上的单链缺口，使两个相邻的核苷酸连接起来，在DNA修复和重组中起着重要作用。
在重组质粒构建过程中，T4 DNA连接酶可以与限制性内切酶配合使用，完成重组质粒构建实验，可催化双链DNA的5'-P端与3'-OH端之间形成磷酸二酯键，对粘端连接和平端连接均有良好的连接效率。

图 1. T4 DNA 连接酶机制

2. T4 DNA连接酶的作用是什么？

2.1 载体构建

在载体构建实验中，不同的限制性内切酶可以产生不同类型的末端，针对不同的末端，T4 DNA连接酶会有不同的连接策略。

2.1.1 用限制性酶进行克隆，单次消化产生粘性末端

载体构建时，如果使用相同的限制性内切酶切割目的基因的DNA片段，且载体分子能产生相同的粘端，则可用T4 DNA连接酶直接进行重组连接。但由于粘端相同，目的基因可以正向或反向插入载体，容易增加筛选正确重组克隆的工作量。可考虑采用双酶切法进行载体构建。
另外，单酶切制备的载体的粘性末端也可配对，然后在T4 DNA连接酶的作用下，核苷酸间形成磷酸二酯键，导致载体自连接。用碱性磷酸酶处理消化后的载体，可以去除载体5’端的磷酸基团，使载体不能完成自连接。这样，在T4 DNA连接酶的作用下，载体与目的片段连接起来，完成重组载体的构建。

2.1.2 用限制酶进行克隆，通过双重消化产生粘性末端

在载体构建过程中，如果用两种粘末端不同的限制性内切酶分别酶切目的片段和载体，就会产生两种不同的粘末端。此时，T4 DNA连接酶可以选择性地连接相同的粘末端，以保证目的片段以正确的方向插入载体。当图2中的目的片段和载体同时用EcoR I和BamH I酶切时，就可以连接相同的粘末端。目的片段与载体的连接方向只有一个。

图 2. 双酶切产生的粘端连接^[1]

2.1.3 限制性片段的克隆，平末端

一些限制性内切酶在酶切过程中也能产生平末端，如Sma I等。T4 DNA连接酶可直接在载体和插入片段间形成磷酸二酯键，无需碱基配对，但此方法连接效率低，且易发生载体自连接。一般可将平末端转化为粘性末端再进行连接，如在目的片段和载体末端分别加入互补的poly A和poly T碱基，人为形成粘性互补末端，通过末端脱氧核苷酸转移酶提高连接效率。

2.1.4 TA克隆

TA克隆所用的T载体在3’端有一个T-overhang，当目的片段的DNA序列不清楚时，可用TA克隆的方法将目的基因片段连接到T载体上，通过测序确定目的基因。PCR所用的Taq DNA聚合酶具有末端转移酶活性，可在DNA片段的3’端添加一个核苷酸“A”。T4 DNA连接酶可将Taq DNA聚合酶扩增的产物直接连接到T载体上，PCR扩增产物无需添加人工接头即可达到高效克隆的目的。

图3. TA克隆的工作流程^[2]

2.2 NGS 接头连接

在构建新一代测序文库时，需要将人工接头与PCR产物连接，才能将其固定在测序芯片上的流动槽上，完成测序。TA克隆连接接头建库是一种非常常见的技术手段，其原理与上述TA克隆类似。待测序的DNA片段在5’端磷酸化后，在3’端添加“A”，与带有“T”粘端的接头互补配对，形成完整的双链，然后由机器进行测序。
在TA连接过程中，不同的样本类型或者核酸片段结构的复杂程度都会影响连接的效率，因此不同平台的adapter也会对最终的建库结果产生影响。
例如华大智造平台的Bubble adapter具有特殊的二级结构，对T4 DNA连接酶的连接效率要求非常高，连接效率的降低直接影响文库的产出。

图 4. 通用接头连接流程

3. Yeasen Biotech T4 DNA 连接酶可用于 NGS 接头连接

Yeasen 专门开发的生物技术 快速 T4 DNA 连接酶 用于NGS建库过程中DNA片段与接头的连接。该酶具有高效的连接能力，不仅连接速度快而且兼容多种类型的样本，更有利于连接结构复杂的核酸片段。目前已通过大量客户的高通量测序验证。对于华大智造平台上Bubble接头的连接，同样可以获得优异的测序质量。

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA 连接酶具有超高连接效率

使用 Yeasen Biotech Fast T4 DNA连接酶构建不同接头类型的文库。样本为170 bp的cfDNA mimic，使用Agilent 2100文库检测结果。 ①未连接接头的产物； ②单端接头的产物； ③双端接头的产物； ④残留接头。从结果可以看出，单端和双端接头的连接效率都很高。

图 5. Agilent 2100 检测到的不同类型的连接产物

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA 连接酶，具有出色的文库产量

使用Fast T4 DNA连接酶进行不同类型的文库构建，与其他T4 DNA连接酶相比，文库产量更佳。

表 1. 不同种类样本的文库产量

4. 选择指南 Yeasen Biotech T4 DNA 连接酶

Yeasen 是一家从事分子、蛋白质、细胞三大生物试剂研发、生产和销售的生物技术公司。除了 Fast T4 DNA 连接酶， Yeasen 生物技术也有 新型 T4 DNA 连接酶 和 快速T4 DNA连接酶 可供选择。您可以根据下表显示的应用程序进行选择：

表 2：相关产品

参考

[1]袁伟.基因工程[M].化学工业出版社，2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. 合成生物学的克隆基因 - ScienceDirect[J]. 分子生物学(第三版), 2019:199-239。
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM 等. DNA连接酶:结构、反应机理和功能[J]. 化学评论, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA连接酶:进展与展望[J]. 生物化学杂志, 2009, 284(26):17365-17369.