Teln端粒酶：DNA酶促合成中的新驱动器

说到端粒和原核端粒酶 在生物学中，人们首先想到的往往是衰老，这是一种不可避免的自然现象。端粒 是 真核生物染色体末端的重复 DNA 序列，含有 维持染色体完整性和调节细胞分裂周期的责任。

原核端粒酶 是一种逆转录DNA合成酶，可延长端粒。它是由RNA和蛋白质组成的核蛋白。 该蛋白质成分可以催化端粒重复序列的合成 与 RNA 成分。

图 1. 原核端粒酶介导的端粒延伸机制[1]

原核端粒酶 可以修复和延长端粒，弥补DNA复制的缺陷，防止细胞分裂时端粒丢失，增加细胞分裂次数。2009年，诺贝尔生理学或医学奖授予伊丽莎白·H·布莱克本、卡罗尔·W·格雷德和杰克·W·绍斯塔克，以表彰他们在揭示端粒和原端粒酶的关键作用方面做出的杰出贡献 细胞功能和衰老。

今天，我想向大家介绍一种独特的Protelomerase：TelN proProtelomerase。TelN Protelomerase 来自噬菌体N15，是N15复制系统的组成部分，参与 在线性原噬菌体 DNA 的生成中。与原核端粒酶不同 在真核生物中，TelN 是一种纯蛋白质酶，不含任何 RNA 成分。它具有切割-连接 活性，切割双链 DNA（dsDNA）后在切割位点处留下共价闭合末端。

图 2. TelN 原核端粒酶 切割位点

TelN原核端粒酶 作用机制

TelN 原核端粒酶识别位点 是一个56bp长的回文序列，两侧为telR和telL，靶序列中央位置也是一个回文序列telO。TelN 原核端粒酶 在telO序列内进行切割，在切割的两个末端形成共价闭合的发夹结构。消化后的DNA末端仍然由telR和telL组成，称为 狗骨头 DNA（dbDNA）。

图 3. 原核端粒酶 TelN 位点的切割机制[2]

由于TelN Protelomerase的特殊酶切-连接活性，环状质粒DNA通过一步酶促反应即可转化为线性共价闭合的哑铃状分子。与线性开放DNA分子相比，线性闭合DNA在细胞中具有更高的蛋白表达水平，非常适合构建具有高稳定性和极小外来序列的线性闭端迷你DNA。质粒DNA作为mRNA疫苗、DNA疫苗和细胞基因治疗的核心元件起着至关重要的作用。传统的质粒生产方法是发酵法， 大肠杆菌 质粒的制备需要经过多级扩增，发酵过程中风险不可控，限制了优质质粒的产出，成为制约疫苗产能的关键。英国Touchlight公司推出了创新性的dbDNA技术，该技术颠覆了传统的细菌发酵制备质粒DNA的方法，而是采用体外酶法合成DNA，并利用TelN Protelomerase特殊的酶切连接活性，生成线性封闭末端的mini DNA。

TelN原核端粒酶在DNA酶促合成中的应用

基于phi29 DNA聚合酶和TelN Protelomerase的DNA体外酶法合成可以避免生物发酵过程中的诸多不可控风险，并且体外酶法合成DNA速度快、产量高，合成的DNA可以应用于mRNA疫苗、DNA疫苗、基因治疗载体、基因编辑等诸多新兴技术。

图4. DNA酶合成流程图[3]

酶促 DNA 合成过程

  1. 模板变性

环状质粒DNA模板通过变性过程转变为两个单链环状DNA。

  1. 滚环扩增

利用Phi29 DNA聚合酶和单链环状DNA进行滚环扩增，生成具有Protelomerase识别序列间隔的长线性双链串联DNA。

  1. 切割和共价闭合

TelN 原端粒酶识别端粒复合体 DNA 上的 telRL，并进行切割-连接活性以生成线性、共价连接的 DNA 单体。

  1. 去除细菌骨架 DNA

限制性内切酶或外切酶将末端具有开放结构的细菌骨架DNA降解，得到仅含有目的基因表达元件的DNA。酶法合成DNA技术绕过生物发酵，可快速实现GMP级质粒DNA合成，解决了基因治疗、mRNA疫苗等领域产能限制，具有巨大的产业化潜力。为推动DNA酶法合成技术的发展， Yeasen 生物可提供DNA酶促合成的核心酶材料，如phi29 DNA聚合酶（14404ES）、TelN Protelomerase（14540ES），助力DNA酶促合成技术的研究与生产。

磷演出展示 的 Yeasen的 TelN原核端粒酶

  1. 裂解结扎性能优异，与进口品牌相当。

以含有TelN原核端粒酶识别位点的超螺旋质粒为模板，梯度添加（0.078-5 U）酶 Yeasen 加入品牌A，将0.5 μg超螺旋质粒转化为闭合线性双链DNA（dsDNA），凝胶电泳检测转化效率，结果表明， Yeasen的 TelN 原端粒酶与品牌 A 相当。

图5. TelN的原核端粒酶切割活性检测M：Marker，C：超螺旋质粒对照

  1. 线性dsDNA闭合完整性>90%

以含有TelN Protelomerase识别位点的超螺旋质粒为模板，加入TelN Protelomerase的 Yeasen 和品牌A，将0.5 μg超螺旋质粒转化为闭合线性dsDNA，加入T5外切酶，通过条带降解程度检测其末端完整性。结果表明，TleN Protelomerase产生的dsDNA末端闭合完整性 Yeasen ＞90%，与品牌A相当。

图 6. TelN 原核端粒酶末端闭合完整性检测。C1：含有 TelN 识别位点，不含 TelN 原核端粒酶的质粒；C2：含有 TelN 识别位点、TelN 原核端粒酶，不含 T5 核酸外切酶的质粒；质粒：含有 TelN 识别位点的质粒。

相关产品 的 DNA 酶合成

产品分类

产品名称

目录编号

原核端粒酶

TelN原核端粒酶 （5 单位/微升）

14540ES

Phi29 DNA聚合酶

phi29 DNA 聚合酶（10 U/μL）

14404ES

外切酶

外切酶III

14525ES

T5 核酸外切酶 (10 U/µL)

14538ES

脱氧核糖核酸

dNTP 混合物（各 25 mM）

10125ES

R參考文獻

[1] Giardini MA、Segatto M、da Silva MS、Nunes VS、Cano MI。端粒和原核端粒酶 生物学。Prog Mol Biol Transl Sci.2014；125：1-40。

[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 原核生物裂解连接酶TelN产生的线性闭合微型DNA在哺乳动物细胞中具有功能性。J Mol Med (Berl)。2002;80(10):648-654。

[3] Heinrich J、Schultz J、Bosse M、Ziegelin G、Lanka E、Moelling K. 原核生物裂解连接酶TelN产生的线性闭合微型DNA在哺乳动物细胞中具有功能性。J Mol Med（Berl）。2002；80（10）：648-654。doi：10.1007/s00109-002-0362-2。

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