- 背景
本报告中总结的数据由
汇总数据仅供用户参考，用户需要使用自己的样本验证支原体方法，以确认该方法可以满足用户的要求。建议所有使用该试剂盒的实验室验证以下参数：检测限、特异性和稳健性。
验证内容：
| 表现 | 验证参数 | 验证结果 |
| 检测限 | 支原体菌株检测限 | 对药典规定的10种支原体检测限为10CFU/mL,每种检测24次,检出率≥95%。 |
| 特异性 | 样品基质干扰 | 测试了 9 种不同的样本基质和 DNA 稀释溶液，未检测到支原体。 |
| 交叉反应 | 检测了生物制药中14株菌株及6种常用工程细胞，均未检出支原体。 | |
| 耐用性 | 冻融稳定性 | 可承受20次反复冻融循环而不会影响套件性能。 |
| 热加速稳定性 | 在37°C条件下保存14天以及4°C条件下保存30天不受影响。 | |
| 仪器兼容性 | 与 ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96 和 Roche LightCycler®480 兼容。 | |
| 覆盖范围 | 支原体 DNA 类型的覆盖范围 | 使用支原体 16S rRNA 序列的数据库比较涵盖了柔膜菌纲内的 183 个物种。 |
- 实验材料和方法
2.1 迈凯威商标 支原体实时 qPCR 检测试剂盒 (2G)，供应商：
2.2 分子纯商标 磁性残留 DNA 样本制备试剂盒，供应商：
2.3 支原体敏感度标准品购自Minerva Biolabs（MB），其菌株来自国家典型培养物保藏中心（NCTC）。敏感度标准品为灭活支原体，用于支原体检测核酸扩增法（qPCR/PCR法）的方法学验证。共购买10种支原体，包括EP 2.6.7和JP G3的要求。标准品信息如下：
| 小贩 | 货号 | NCTC 编号 | 热带气旋中心 不。 | 材质名称 |
| Minerva 生物实验室（MB） | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 精氨酸支原体 |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 口腔支原体 | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 鸡毒支原体 | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 肺炎支原体 | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 滑液支原体 | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 发酵支原体 | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 猪鼻支原体 | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 莱氏无胆甾原体 | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ 灵敏度标准 柑橘螺原体 | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10菌落形成单位™ 灵敏度标准 唾液支原体 |
2.4 原始资料：电子版记录于《实验报告》 父文件“MycAway”的子文件商标 支原体实时 qPCR 检测试剂盒（2G）'。
2.5 方法：实验所用材料及操作方法基本由
- 资格审查内容及结果
3.1 检测限（LOD）
按照标准菌株说明书和提取检测试剂盒说明书对10 CFU/mL支原体标准菌株进行核酸提取及检测，对10 CFU/mL支原体标准菌株共进行24次检测，每次实验同时检测NCS（阴性对照样品）和NTC（无模板对照）样品。
结果显示，NCS和NTC结果令人满意，24个104CFU/mL样品全部检测呈阳性，符合24次检测中至少有23次呈阳性的要求。
| 不。 | 材质名称 | 菌液浓度 |
| 1 | 精氨酸支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 2 | 口腔支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 3 | 鸡毒支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 4 | 肺炎支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 5 | 滑液支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 6 | 发酵支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 7 | 猪鼻支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 8 | 无胆甾原体 莱德劳 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 9 | 柑橘螺原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
| 10 | 唾液支原体 | 10菌落形成单位/毫升 |
表 1 已验证菌株的信息
| 10菌落形成单位/毫升 | 实验 1 | 实验 2 | 实验 3 |
| 检测率 | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| 全部的 | 24/24 | ||
表2 检测限结果
3.2 特异性
3.2。1 支原体检测范围
将试剂盒中的引物探针序列与数据库中的16S rRNA基因组进行比对，通过生物信息学分析，得出MycAway商标 NextSense Biologicals 的支原体 qPCR 检测试剂盒（探针法）可以覆盖至少 183 种虫黄藻，其中包括 120 种支原体、9 种脲原体、33 种螺原体和 7 种胆囊线虫等。
3.2。2 样品基质干扰
9 种底物（Dulbecco 的 MEM、Ham 的 F-10 培养基、M-199 培养基、Ham 的 F-12K Kaighn 的培养基、RPMI-1640 培养基、McCoy 的 5A、Ham 的 F-12K Kaighn 的 +1.0mM/L 谷氨酰胺、L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2。05 mM L-Glutamine、DMEM-低糖标准培养基)为样品验证样品基质干扰,结果显示该培养基对试剂盒试剂无干扰。
3.2。3 屈挠杆菌检测范围
需要提取和检测 10 CFU/mL 的灭活支原体（精氨酸支原体、口腔支原体、鸡毒支原体、肺炎支原体、滑膜支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆汁支原体、柑橘螺原体、唾液支原体），以及 NCS 和 NTC 样品测试。
结果显示，NCS、NTC均未检出，结果为阴性；10种支原体全部检出，结果为阳性。
3.2。4 交叉反应
对于 14 种非柔韧性细菌菌株，包括梭菌（产气荚膜梭菌、丙酮丁酸梭菌）、乳杆菌（嗜酸乳杆菌）、链球菌（变形链球菌、肺炎链球菌），许多其他常见的芽孢杆菌-球菌-真菌微生物（表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌、白头假单胞菌、肠道沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌属、蜡样芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌），以及六种工程细胞（HEK293、293T、Vero、CHO、大肠杆菌、 SF9) 用于使用 MolPure 检测支原体商标 磁珠法残留DNA样本预处理试剂盒（瓶装）及MycAway商标 支原体qPCR检测试剂盒（探针法）（2G），每个实验与PCS、NCS、NTC样品检测同时进行。
结果显示，PCS、NCS、NTC结果满意，检测样品均为阴性，未发生交叉反应。
3.3 稳健性
3.3.1 冻融稳定性
对支原体检测试剂盒在-25℃~-15℃条件下进行冻融实验，结果显示，该试剂盒可承受20次反复冻融，性能不受影响。
3.3。2 加速稳定性
支原体检测试剂盒分别在37℃热加速14天和4℃热加速30天，结果显示产品性能不受影响。
3.3。3 仪器适用性
对于支原体检测试剂盒，以试剂盒中不同浓度的阳性对照和肺炎支原体DNA作为待测样本，分别在Thermo Scientific ABI7500、Thermo Scientific ABI Q5、上海宏实SLAN-96S、Roche LightCycler®480四个不同品牌和型号的仪器上进行实验。实验在上海宏实SLAN-96S、Roche LightCycler®480四种不同品牌和型号的qPCR仪上进行。
结果显示，待测样本在不同厂家型号的qPCR仪上进行检测，阴性对照结果均合格，试剂盒性能未受影响。
- 4。参考
4.1 支原体检查法<3301>。中国药典三部[S]。北京：中国科学技术出版社，2020：542-543。
4.2分析方法验证指导原则<9101>。中国药典三部[S]。北京:中国科学技术出版社,2020:682。
4.3 药品微生物检测替代方法验证指导原则<9201>。中国药典三部[S]。北京:中国科学技术出版社, 2020: 684。
4.4 支原体。欧洲药典[S]。第 10 版，2020 年：第 2.6.7 节，194-199。
4.5 生物技术/生物制品生产所用细胞基质的支原体检测<G3-14-170>。日本药典[S]。第 18 版，2021：2678-2682。
4.6 Erica J. Fratz-Berilla、Phillip Angart、Ryan J.Graham 等人。故意发生支原体污染事件对 CHO 细胞生物反应器培养中产生的单克隆抗体产品质量属性的影响。生物技术与生物工程。2020；117(9): 2802-2815。
4.7 Dmitriy V. Volokhov、Laurie J Graham、Kurt A Brorson、Vladimir E Chizhikov。细胞底物和生物制剂的支原体检测：替代非微生物技术综述。Mol Cell Probes。2011 年 4 月 - 6 月；25(2-3)：69-77。
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. 一种用于检测兽用疫苗和生物制品中支原体污染的 PCR 检测方法。应用微生物学快报。2015 年 2 月;60(2):174-180。
订购信息
| 描述 | 零件编号 |
| 18461ES | |
| MycAway™ 支原体 qPCR 检测试剂盒 （2G） | 40619ES |