CHO宿主细胞DNA残基检测试剂盒（3G）验证报告

胆固醇 宿主细胞DNA残留检测试剂盒 （3）格）

资格概要（编号： 41332ES60）

1. 背景

本报告中总结的数据由 Yeasen CHO 生物技术 宿主细胞DNA残留检测试剂盒（3G）产品。摘要数据仅供用户参考，用户需自行验证宿主细胞残留 DNA方法通过使用自己的样本来确认该方法是否符合用户的要求。建议所有使用该试剂盒的实验室验证以下参数：线性、范围、准确度、精密度、定量限、特异性和稳健性。

Yeasen 生物技术公司可以提供该试剂盒的详细鉴定报告。如果用户使用此报告，则仅需评估其适用性（包括精密度、 准确性 应验证其有效性和特异性。

2. 实验材料和方法

2.1 胆固醇 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒 (3G)，供应商： Yeasen，货号：41332ES60。

2.2 MolPure 磁性残留 DNA 样本制备试剂盒，供应商： Yeasen，货号：18461ES60。

2.3 原始资料：电子版记录于《实验报告》 父文件的子文件 胆固醇 宿主细胞DNA残留检测试剂盒（3G）。

2.4 方法：实验所用材料及操作方法基本由 Yeasen 经过长期评估和验证的生物技术，试剂盒的开发和生产均遵循ISO 13485体系。

3. 资格审查内容及结果

3.1 检测范围

试剂盒的线性范围为3 fg/μL~300 pg/μL，R²=1，扩增效率为99.09%，各浓度检测的CV<15%。

图 1 CHO DNA (3G) qPCR 标准曲线

3.2 准确性

3.2。1 R生态恢复

3.2.1.1 空白样品加标回收率实验

CHO 样本 高、低浓度 DNA 标准：30 皮克/微升, 300 分别制备100、200、300 fg/μL、300、400 fg/μL样品，采用磁珠法残留DNA样本预处理试剂盒（3 每个样品进行10次重复提取，每次提取进行3次重复测定），并分析样品回收率和CV。

对于不同浓度的DNA样品，回收率为70%~130%，CV均<20%。

样品类型	理论浓度	提取 1 个均值	提取 2 个均值	提取 3 个均值	平均浓度	简历	恢复
空白样品	/	/	/		/	/	/
恢复示例 1	30 皮克/微升	27.07	27.51	28.27	27.62	2.20%	92.06%
恢复示例 2	300 克/微升	285.53	301.25	295.71	294.16	2.71％	98.05％
恢复示例 3	3微克/微升	3.50	3.54	3.31	3.45	3.56%	115.00%

表1 空白样品加标回收率

3.2.1.2 模拟样品加标回收实验

用 5 种不同的背景溶液（高蛋白、高核酸、高和低 pH、高盐）提取相同浓度（300 fg/μL CHO DNA）的样品（每个样品进行 3 次提取重复，每次提取进行 3 次测定重复），并分析样品回收率和 CV。

不同背景溶液的 DNA 样本回收率范围为 70% 至 130%，所有 CV 均 <20%。

样品类型	理论浓度	提取 1 个均值	提取 2 个均值	提取 3 个均值	平均浓度	简历	恢复
基本示例	/	/	/		/	/	/
高蛋白	300 微克/微升	302.29	332.86	342.76	325.97	6.47％	108.66%
高核酸		284.47	290.66	308.76	294.63	4.28％	98.21％
高盐		272.96	286.25	312.91	290.71	7.00％	96.90％
高 pH 值		296.04	320.58	324.56	313.72	4.92％	104.57%
低 pH 值		314.77	327.89	340.26	327.64	3.89％	109.21％

表 2 基本样品加标回收率

3.3 精度

3.3.1 重复性

对浓度为 3 fg/μL 的 CHO DNA 标准重复测定 10 次，CV <15%。

重复	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	意思是	简历％
检测值 (fg/μL)	3.13	3.26	2.89	3.16	2.95	2.87	2.88	2.75	2.87	3.15	2.99	5.65％

表3 重复性结果

3.3。2 中间精度

三位实验人员独立检测了高、低浓度的CHO DNA标准样品：300 pg/μL、3 pg/μL、3 fg/μL，每个浓度做了三次重复实验，所得九个数据的CV均<15％。

经验值	实际浓度 理论浓度	CHO DNA（3G）
		300 皮克/微升	3皮克/微升	3微克/微升
实验 1	决定 1	302.63	2.97	3.40
	决定 2	294.54	3.01	3.14
	决定 3	287.67	2.99	3.01
实验2	决定 4	292.27	2.92	3.四十七
	决定 5	299.61	2.90	2.82
	决定 6	305.73	2.93	2.90
实验 3	决定 7	301.06	3.17	3.15
	决定 8	299.17	3.00	3.21
	决定 9	290.66	2.90	3.05
/	意思是	297.04	2.98	3.13
/	简历％	2.03	2.80	6.85

表4 中间精密度结果

3.4 特异性

对生物制品生产中常用的细胞基因组DNA对CHO DNA检测试剂的干扰进行了评价，干扰组与对照组重叠，未见到干扰（下图依次为小鼠、MDCK、HEK293、E.coli基因组DNA对CHO DNA检测试剂的干扰数据）。

图2 干扰实验结果

3.5 定量限

对CHO DNA以3 fg/μL、1 fg/μL、0.5 fg/μL、0.3fg/μL、0.1 fg/μL进行检测，每个浓度重复10次，结果显示0.3 fg/μL及以上浓度的CV<20%，即CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（3G）的定量限为0.3 fg/μL。

重复 测试项目	CHO DNA（3G） （fg/μL）
	数量	重算比率%
1	0.28	93.33%
2	0.26	86.67％
3	0.32	106.67%
4	0.30	100.00%
5	0.33	110.00%
6	0.23	76.67％
7	0.29	96.67％
8	0.37	123.33%
9	0.31	103.33%
10	0.28	93.33%
意思是	0.30	/
简历％	13.09％	/

图 3. CHO DNA (3G) qPCR 检测结果

3.6 检测限

对CHO DNA以0.3 fg/μL、0.1 fg/μL、0.05 fg/μL、0.01 fg/μL进行检测，每个浓度重复20次，结果显示0.05 fg/μL及以上浓度，20个重复孔中检出率≥19（即检出率≥95%），即CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（3G）的检测限为0.05 fg/μL。

图 4. CHO DNA (3G) qPCR 检测结果

3.7 稳健性

本套件已经过测试，适用于（但不限于）以下仪器：

小贩	仪器型号	扩增效率	R2	定量限	简历	检测限	检测率
热	澳大利亚商业信息局 7500	99.69％	1	0.3 微克/微升	12.40％	0.05 微克/微升	95.65％
热	ABI QuantStudio5	99.26％	1	0.3 微克/微升	15.30％	0.05 微克/微升	100.00%
罗氏	LightCycler480	2.05％	0.978	0.3 微克/微升	/	0.05 微克/微升	/
上海红石	斯兰	101.14％	0.999	0.3 微克/微升	14.41％	0.05 微克/微升	95.65％

表5 仪器适用性试验结果

3.8 稳定性

3.8.1 冻融稳定性

CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（3G）经10次反复冻融测试，试剂盒性能未受影响。

测试指标 冻融时间	范围	T0时间	冻融10次
标准曲线参数	扩增效率	95.70%	98.62％
	R2	1	1
定量限 (0.3 fg/μL)	简历	15.31％	17.16％
检测限 (0.05 fg/μL)	检测率	95.65％	100％

表6 冻融稳定性结果分析

3.7。2 加速稳定性

CHO 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒 (3G) 分别在 2~8°C 下保存 30 天和在 37°C 下保存 14 天。试剂盒的性能均未受到影响。

测试指标 加速温度和时间	范围	实验 1		实验 2
		T0时间	2~8℃ 30 天	T0时间	37℃ 14天
标准曲线参数	扩增效率	100.53%	102.61％	101.76％	101.84％
	R2	1	1	1	1
定量限 (0.3 fg/μL)	简历	17.16％	12.63％	16.27％	12.49
检测限 (0.05 fg/μL)	检测率	95.65％	100％	95.57％	100％

表7 加速稳定性结果分析

3.9 空白限量

3.9.1 无模板对照 (NTC)

无模板对照（NTC）是对DNA稀释液进行96次重复进行qPCR定量检测，所检测的96个重复孔中所有CT值均>40。

图5 NTC实验结果

3.9。2 阴性提取对照样品 (NCS)

阴性提取对照样品（NCS）为DNA稀释液，先通过样品预处理提取，然后进行qPCR，检测的48个重复孔中所有CT值均>40。

图 6 国家计算机系统公司 实验结果

4. 4。参考

4.1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（三部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，p.542-543, 2020.

4.2国家药品监督管理局，2007年：《生物制品质量控制分析方法验证技术审查通则》。

4.3 ICH(2022)《分析方法验证Q2》，征求意见稿。

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