自2022年3月狡猾的奥密克戎变异毒株再次打破人们平静的生活以来，新型冠状病毒疫情在全国爆发，波及30个省（区、市）。作为精准防控新冠肺炎疫情的有效手段，核酸检测已经成为人们日常生活的常态。“今天你做核酸检测了吗？”也成为人们每天的问候语。说到这里，你知道核酸检测需要哪些核心原料吗？本文就来为大家介绍一下核酸检测酶中关键的核心原料。

1. SARS-CoV-2 核酸检测流程

2. 核酸提取的核心酶

3. RT-qPCR 过程中的核心酶

4. 新冠病毒核酸检测核心酶 Yeasen

1. SARS-CoV-2核酸检测流程

酶是一类极其重要的生物催化剂，具有较高的催化效率和反应专一性，绝大部分生化反应都需要酶的参与。在2019-nCoV核酸检测过程中（如图1所示），不同类型的分子酶在核酸提取、RT-qPCR等不同实验阶段发挥着重要作用。接下来，我们将根据核酸检测中不同的实验环节，对核酸检测过程中使用的核心酶原料进行梳理。

图1. SARS-CoV-2核酸检测流程

2. 核酸提取的核心酶

新冠病毒核酸提取过程主要包括裂解和纯化两个步骤。裂解是破坏样品的细胞结构，使样品中的核酸游离于裂解体系中的过程；纯化是将核酸与裂解体系中的其他成分，如蛋白质、盐和其他杂质完全分离，反应过程需要蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶I和RNase抑制剂的参与。

2.1 蛋白酶K

蛋白酶K是一种具有广泛切割活性的丝氨酸蛋白酶，切割位点为脂肪族和芳香族氨基酸的羧基末端肽键（图2）。在核酸提取过程中，蛋白酶K可以降解与核酸紧密结合的组蛋白，促进核酸的分离，使样品核酸更易于提取。此外，蛋白酶K还可以降低RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase对模板RNA的水解。

图2.蛋白酶K水解肽键示意图

Yeasen 生物技术 蛋白酶K (Cat#10401ES)来源于重组酵母菌株，比活力≥30 U/mg，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶活稳定，pH范围宽（pH 4.0~12.0）有活性，适用于原位杂交样品制备、核酸纯化等蛋白质的裂解去除。

2.2 脱氧核糖核酸酶I

脱氧核糖核酸酶I（DNase I）可以催化多种形式的DNA，靶向切割嘧啶相邻的磷酸二酯键，生成5'端带有磷酸基团、3'端带有羟基的多核苷酸，平均消化产物为最小的多四核苷酸。在SARS-CoV-2核酸提取过程中，DNase I主要用于去除RNA样本中的基因组污染，避免RNA模板中DNA残留，提高模板的纯度。

Yeasen 生物技术 脱氧核糖核酸酶 （Cat#10325ES）来源于重组大肠杆菌，不含RNase，可用于处理多种RNA样本。最佳工作pH范围为7.0-8.0。在Mg2+存在下，DNase I可以随机切割双链DNA的任意位点；而在Mn²⁺其中，DNase I可以在同一位点切割双链DNA，形成平末端或1-2个核苷酸悬垂的粘性末端（如图3所示）。

图3. DNase I 在Mg存在下切割dsDNA的示意图²⁺ 和锰²⁺

2.3 RNase抑制剂

在SARS-CoV-2核酸检测过程中，样本核酸的提取纯化或实验反应体系的制备可能会引入核糖核酸酶（RNase）污染，导致RNA模板的降解。为避免RNase污染，需要使用RNase抑制剂。

RNase Inhibitor是人胎盘中的特异性RNase抑制剂，能够特异性地与RNase结合，以非共价键形成复合物，使RNase失活。 Yeasen 生物技术 小鼠 RNase 抑制剂 (Cat#10603ES)不含人体蛋白中对氧化极为敏感的两个半胱氨酸，具有更高的抗氧化活性，能广泛抑制各类RNases（RNase A、B、C），更适合qPCR等对高二硫苏糖醇（DTT）敏感的实验。

3. RT-qPCR 过程中的核心酶

SARS-CoV-2样本核酸提取完成后，可通过RT-qPCR完成核酸检测。在这些实验过程中，DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是必不可少的核心酶原料。

3.1 逆转录酶

新冠病毒RNA提取纯化后，需要逆转录酶催化dNTP聚合生成与模板RNA互补的cDNA序列（图4）。进行RT-qPCR反应，应选择耐高温的逆转录酶。目前应用最为广泛的是MMLV逆转录酶，由于其缺乏DNA内切酶活性和较低的RNase H活性，在cDNA克隆应用中更具有优势。

图4.逆转录过程示意图

Yeasen 生物技术 希菲尔™ V 逆转录酶 （Cat#11300ES）是通过基因工程技术获得的新型逆转录酶，具有良好的热稳定性，可承受高达60℃的反应温度，并且是 适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录，同时该酶与模板的亲和力增强，适合少量模板和低拷贝基因的逆转录，可扩增长达10kb的cDNA。

3.2 DNA聚合酶

模板逆转录过程完成生成双链cDNA后，需要PCR反应中的“灵魂选手”DNA聚合酶登场，通过聚合游离的脱氧核糖核苷酸来延长DNA链，在体外对大量模板DNA进行扩增，达到病毒核酸检测的目的。

RT-qPCR反应中常用的DNA聚合酶是热启动Taq DNA聚合酶。此类酶在室温下无活性。它只有在热启动后才具有聚合活性，可以最大程度地减少背景信号的产生，解决了常规PCR反应中由于引物二聚体的产生或错配而导致的非特异性扩增问题。目前常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰和抗体修饰，不同热启动修饰方法的原理如图5所示。

图5. 不同类型的修饰热启动酶示意图

Yeasen 生物技术 UNICONTM Hotstart 高特异性 Taq DNA 聚合酶，5 U/μL（Cat#10726ES）是一种双阻断热启动 DNA 聚合酶，具有较高的模板亲和力。在室温下，不仅 5'→3' 聚合酶活性被阻断，但 5'→3' 阻断外切酶活性。95℃变性30秒可完全灭活阻断抗体，释放DNA聚合酶活性和外切酶活性。双重阻断特性不仅可以有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，还可以有效抑制探针降解引起的荧光信号下降。双重保障使体外检测试剂在运输或室温使用过程中更加稳定。

3.3 尿嘧啶DNA糖基化酶

在新冠病毒核酸检测过程中，操作环境中的气溶胶污染是造成PCR结果假阳性最常见的因素。在扩增体系中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）可有效消除混入PCR体系中的扩增残留污染物（大多以气溶胶形式存在），保证扩增结果的准确性。UDG酶的防污染原理如图6所示。

图6. UDG酶抗污染原理示意图

Yeasen 生物技术 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），热不稳定性，1 U/μL（Cat#10303ES）在25-37°C下有活性，热敏感，50°C 10分钟或95°C 2分钟不可逆失活。无内切酶和RNase残留，宿主菌基因组残留量小于10拷贝。可与热启动Taq DNA聚合酶配合使用，保证扩增反应的特异性。

4.SARS-CoV-2 核酸检测核心酶 Yeasen

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