优化工业生产和自我扩增mRNA的净化

尽管在疫情期间取得了良好的效果并显示出巨大的潜力，但 mRNA 技术仍然存在一些局限性，例如表达时间短和蛋白质翻译有限。虽然这些特点可以提供一定程度的安全性，但它们成为蛋白质替代等疗法的限制。这需要反复给药以维持蛋白质表达水平，从而带来新的风险和挑战，例如免疫原性和中和抗体。

自扩增 RNA (saRNA) 可以以比传统 mRNA 小数百倍甚至数千倍的剂量产生相同的免疫反应。较低的剂量意味着较低的生产成本，而较少的注射频率可以减少 mRNA 和递送载体的潜在毒副作用。目前，全球已有多种 saRNA 候选药物进入临床试验。BioNTech 等大公司正在积极开发 saRNA 技术管线。

尽管saRNA具有显著的成本和安全优势，但其独特的结构也带来了新的生产挑战。saRNA分子由编码RNA聚合酶的序列和靶蛋白序列组成，比传统的mRNA大得多（约10kb），也更复杂（包含更多的二级结构）。这大大增加了体外转录反应的难度，降低了saRNA生产的产量和纯度。因此，saRNA的生产对合成、分离和纯化工艺的要求更高。

亲和层析作为分离纯化的方法，存在目标产物收率低、完整性差等问题，而多种层析纯化方法联合使用（如加入纤维素层析、疏水反相层析等）操作繁琐、引入新杂质、回收率低、成本高。另外，用于大规模生产的IVT反应体系是从适合合成100nt核酸序列的体系优化而来的，不适用于超过10kb的saRNA，这就需要对现有的IVT反应体系进行优化。目前常规的mRNA纯化方法无法满足工业原液质量要求，因此迫切需要开发和优化一套完整、高效的自扩增RNA工业级分离纯化工艺。

工业生产和纯化方法的优化

要开发自扩增 mRNA (saRNA) 的工业生产系统，首先必须小规模优化 IVT 共转录系统中的缓冲离子类型和成分。这还涉及改进色谱缓冲液和样品洗涤比例，以用于下游纯化过程。然后可以将这些优化条件扩大到大规模生产，以验证该系统是否能有效提高生产能力并改善原始产品质量。

共转录加帽反应体系

在共转录加帽反应体系中，T7缓冲液成分包括400mM HEPES，20mM亚精胺，100mM DTT，Mg2+盐。

T7缓冲液-镁离子盐型

所用的镁离子盐的类型会影响目标 saRNA 产品的产量和完整性。

1. 对于1mg mRNA的小规模共转录合成，使用Mg(OAc)2作为Mg2+盐可获得最佳的产量和完整性，分别为100.5µg和62.9%。
2. 相比之下，使用其他镁离子盐如MgCl2和MgSO4会导致产量降低约25-50%，完整性降低约10%，显著降低产量和完整性。

T7 缓冲液 - 镁离子浓度

乙酸镁离子的最佳浓度（30-50mM）可提高目标saRNA的产量和完整性，其中35mM时效果最佳。

1. 在醋酸镁离子浓度为30-50mM时，saRNA产量达到88.5-100.5µg，完整性为58.6-62.9%，显示出良好的结果。
2. 在浓度为35mM时产量和完整性最高，分别达到100.5µg和62.9%。

T7缓冲液-镁离子盐与其他盐的结合

在T7缓冲液中添加其他盐可以显著提高目标产品的产量和完整性。

1. 基础 T7 缓冲液包括 400mM HEPES、20mM 亚精胺、100mM DTT 和 Mg2+ 盐，产量和完整性分别为 100.5µg 和 62.9%。
2. 添加第二种盐 NaOAc 可进一步提高产量和完整性：产量增加 20-110µg，完整性提高约 2-8%。

T7 缓冲液 - 组合盐浓度

当第二种盐组分NaOAc（Na+）浓度为5-30mM时，目标saRNA的产量和完整性显著提高，最佳浓度为15mM。

1. 在Na+浓度为3-30mM时，saRNA产量可达120-210µg，完整性为64.4-70.2%，显示出良好的结果。
2. 当Na+浓度为15mM时，产量和完整性最高，分别达到210µg和70.2%。

单一纯化方法

在小规模（<50mg）saRNA生产纯化过程中，采用不同的纯化方法可以显著降低dsRNA含量和蛋白残留，保证较高的产量、封端效率和产品完整性。纯化方法的效果由好到坏依次为：亲和层析>氯化锂沉淀>超滤、纤维素层析。

1. 亲和层析

对于大规模 mRNA 生产，色谱法是首选。选项包括反相色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法和亲和色谱法，每种方法都有其优缺点。亲和色谱法通常用于捕获 poly(A) mRNA，可提供可扩展性和平台解决方案，回收率 >90%。

mRNA 的主要结构特征是 5' 帽和 3' poly(A) 尾，有助于纯化。亲和层析类似于磁珠纯化，使用 dT 连接的珠子捕获 poly(A) 尾 mRNA。高盐条件屏蔽负电荷，允许通过 AT 氢键结合，mRNA 在温和的中性 pH 和低电导率下洗脱。

RNA 亲和层析涉及“高盐结合、低盐洗脱”。缓冲液成分、分子大小、温度和样品浓度对该过程有显著影响。通过实验选择最佳盐类型和浓度对于高效纯化至关重要。

纯化：此方法产品完整度最高（80.3%）、dsRNA含量最低（0.01µg/mg）、封端效率最高（96.4%）、蛋白残留最少（1.20µg/mg），产量为136µg，回收率为65%，产品纯度和质量最优。

2. 其他净化方法：

氯化锂沉淀

使用LiCl纯化mRNA的原理是，在一定的pH值下，锂可以降低分子间的静电排斥，从而实现RNA高效沉淀。沉淀物通过离心分离，溶解后得到纯RNA样品。LiCl沉淀简单、快速，对各种大小的mRNA都有效，且产品纯度高。但残留的锂离子会抑制mRNA。建议对含有至少400 µg/ml RNA的溶液使用LiCl沉淀，以确保纯化效率。 该方法产量较高（210µg），但产品完整度仅为70.2％，大大降低了产品质量，不适合大规模生产。

磁珠法：

磁珠是在磁场下定向移动的小颗粒，通常由氧化铁核心和外部涂层组成。磁珠纯化是一种常见的分子生物学技术，用于从混合物中快速高效地富集 mRNA 分子。不同功能的磁珠具有不同的表面功能基团（例如羟基、羧基、Oligo(dT)、链霉亲和素），可用于纯化各种生物分子。

羧基化磁珠可有效纯化核酸，mRNA 分子在酸性条件下通过静电相互作用结合。调整条件可实现 mRNA 的选择性结合和释放。较长的 mRNA 具有更多暴露的带负电荷的磷酸基团，因此更容易与磁珠结合。对于较短的 mRNA，可能需要更大的磁珠体积。寡核苷酸 (dT) 偶联磁珠与亲和层析类似，利用 mRNA 的 poly(A) 尾与磁珠的寡核苷酸 (dT) 之间的特异性结合。

超滤

该方法导致saRNA完整性最低，比亲和色谱法低约8%，蛋白质残留量最高（4.58µg/mg）。

纤维素色谱法

该方法dsRNA含量较低（0.009µg/mg），封端率较高（96.4%），但蛋白残留稍高（5.30µg/mg），回收率仅为57%，得率为120µg，均明显低于亲和层析法（分别约10%和16µg）。

净化过程

色谱缓冲液成分-添加还原剂

在纯化过程中在层析缓冲液中添加还原剂，与不添加还原剂相比，可以显著提高产品完整性、回收率和封端效率，同时降低副产物dsRNA和蛋白质残留物的含量。

1. 未使用还原剂：

- 产量：136µg

恢复率：65％

- 诚信度：80.3%

- 双链RNA：0.01µg/毫克

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：1.20µg/mg

- 产品纯度和质量良好。

2. 使用还原剂（TCPE、DTT、β-巯基乙醇）：

- 产量增加10-40µg

- 恢复率增加5-18％

- 完整性提高约 1-5%

封盖效率：96.4％

- dsRNA：低至 0.005µg/mg

- 蛋白质残留量：低至0.20µg/mg

- 产品纯度和质量显著提高。

色谱缓冲液成分 - 还原剂类型

在层析缓冲液中添加不同类型的还原剂，可进一步提高产品完整性、回收率和封端效率，同时减少dsRNA和蛋白质残留，其中TCPE是最有效的还原剂。

- 使用 TCPE：

- 产量：175µg

恢复率：83％

- 诚信度：85.2%

- 双链RNA：0.005µg/毫克

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：0.20µg/mg

- 卓越的产品纯度和品质。

色谱缓冲液成分-还原剂浓度

在层析缓冲液中添加5-15mM浓度的还原剂，可以显著提高产品完整性、回收率、封端效率，同时降低dsRNA和蛋白质残留，最佳浓度为10mM。

1. 添加 5-15mM TCPE：

- 产量：160-178µg

恢复率：76 85％

- 完整性：约85%

- 双链RNA：0.002-0.005µg/mg

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：0.20-0.52µg/mg

- 产品纯度和质量好。

2. 使用 10mM TCPE：

- 产量：178µg

恢复率：85％

- 诚信度：85.4%

- 双链RNA：0.002µg/毫克

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：0.20µg/mg

- 最佳的产品纯度和质量。

洗涤比例

控制洗涤过程中色谱缓冲液与注射用水的比例（10～25）：（75～90）可显著提高产品完整性、回收率、封盖效率，同时降低dsRNA和蛋白质残留，最佳比例为15：85。

1. 比例 (10-25):(75-90):

- 产量：150-179µg

恢复率：71 85％

- 完整性：84-90％

- 双链RNA：0.002-0.006µg/mg

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：约0.20µg/mg

- 产品纯度和质量好。

2. 比例为15:85：

- 产量：179µg

恢复率：85％

- 完整性：90.0％

- 双链RNA：0.002µg/毫克

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：0.20µg/mg

- 最佳的产品纯度和质量。

组合纯化方法

多种纯化方法的组合使用，可进一步降低产品中dsRNA及蛋白残留量，提升产品整体品质。纯化方法的优选顺序为：亲和层析>超滤+亲和层析>亲和层析+纤维素层析>纤维素层析+超滤。单独使用亲和层析可获得最佳效果。

1. 单独亲和层析法：

- 产量：179µg

恢复率：85％

- 完整性：90.0％

- 双链RNA：0.002µg/毫克

封盖效率：96.4％

- 蛋白质残留量：0.20µg/mg

- 最高的产品纯度和质量。

2. 超滤+亲和层析：

- 产量：170µg（比单独使用亲和层析法少 9µg）

- 回收率：81%（比单独使用亲和层析法低4%）

- 诚信度：88.5％

- 双链RNA：0.0015µg/毫克

- 蛋白质残留量：0.18µg/mg

- 与单独使用亲和层析相比，dsRNA 和蛋白质残留量略有减少，但产量和回收率显著降低。该方法更为复杂，纯化时间加倍，成本增加。

3. 亲和层析+纤维素层析/纤维素层析+超滤：

- dsRNA: 比单一方法低 0.005µg/mg

- 产量：少60-100µg

- 回收率：降低 30-40%

- 步骤增加会导致更高的劳动力和材料成本。

大规模生产

在大规模生产中，采用亲和层析、亲和层析与纤维素层析联合使用、超滤与亲和层析联合使用，自扩增mRNA的产量可显著提高至140-185µg，回收率为67-88%，产物完整性为93-94%，dsRNA含量控制在0.0018-0.0020µg/mg，封端效率达到96.1-96.4%，蛋白残留控制在0.04-0.05µg/mg，具有良好的可扩展性和大规模生产的效率。

参考：

[1] LiCl 沉淀法用于 RNA 纯化，检索日期：2024 年 1 月 8 日，来源：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html。

[2] 氯化锂沉淀溶液产品信息表，2024 年 1 月 8 日检索自https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf。

[3] BeyoMag™ RNA Clean 磁珠产品，检索日期：2024 年 1 月 8 日，来自 https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm。

[4] VAHTS RNA Clean Beads 产品，检索日期：2024 年 1 月 8 日，来自 https://www.vazyme.com/product/215.html。

[5] 基于 Dynabeads™ 的固相体外转录和 RNA 纯化，检索日期：2024 年 1 月 8 日，来源： https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D。

[6] RNA Clean XP 性能和数据，2024 年 1 月 8 日检索自 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance。

[7] 赛默飞世尔科技新闻，2024 年 1 月 8 日检索自 https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/39287a37147e22e2d978f7dd9228df58。

[8] 自扩增mRNA原液的工业化生产、分离纯化方法及其应用[P].专利：CN118048418A。 2024.05.17。

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