Cap 结构是 mRNA 疫苗和疗法开发中不可或缺的组成部分。合成 mRNA 技术依靠 Cap1 来增强稳定性、翻译效率，并减少 Toll 样受体 (TLR) 和其他免疫传感器对 mRNA 的先天免疫识别，从而最大限度地减少不必要的免疫激活。这可以防止不良的炎症反应，从而提高治疗性 mRNA 在人体细胞中的稳定性和有效性。
早期发现和 Cap0 结构
20 世纪 70 年代中期，对真核 mRNA 的研究发现了一种现在称为 Cap0 的 5' 末端结构，其中 N7-甲基鸟苷帽 (m7G) 附着在 5' 端的第一个核苷酸上。这种修饰被发现可以保护 mRNA 免受核酸外切酶的降解，协助核输出，并促进核糖体识别以启动翻译。Cap0 是第一个被表征的帽结构，其甲基化仅限于鸟苷帽本身。这种 5' 帽及其功能的发现标志着对真核 mRNA 帽及其在 mRNA 修饰中的作用的理解取得了重大突破。
Cap1的出现
Cap1 结构是真核生物 mRNA 的一个关键特征，在 mRNA 稳定性、翻译和免疫识别中起着关键作用。mRNA 帽结构由一个 N7-甲基鸟苷 (m7G) 通过 5'-5' 三磷酸键与第一个核苷酸连接而成，源于 20 世纪 70 年代对真核生物 mRNA 转录后修饰的早期研究。
5′ 端加帽 mRNA 的结构。【1】进一步研究发现，在大多数真核生物 mRNA 中，帽后的第一个核苷酸（+1 位置）也在核糖的 2'-O 位置发生甲基化，这一过程称为 2'-O-甲基化。这一发现被称为 Cap1 结构 (m7GpppNm)，为 mRNA 修饰增加了另一层功能意义。Cap1 修饰被发现可以微调 mRNA 稳定性并阻止先天免疫系统的免疫识别，特别是在哺乳动物细胞中，它有助于逃避 RIG-I、TLR 和 MDA5 等模式识别受体的识别【2】。这对于 mRNA 代谢和基于 mRNA 的技术的进步都至关重要，包括 mRNA 疫苗接种和基因治疗应用。
mRNA行业的技术挑战和当前解决方案
mRNA 疫苗的广泛应用和优化仍存在一些技术挑战，包括高剂量 mRNA、免疫反应、稳定性和递送问题。mRNA 行业面临的一个重大挑战是需要高剂量的 mRNA 来引发强烈的免疫反应。这是由于以下几个因素造成的：
快速降解： mRNA 本质上是不稳定的，并且易被生物系统中的脱帽酶和核糖核酸酶 (RNases) 降解。
翻译效率有限： mRNA 翻译成蛋白质的效率各不相同，需要更多量的 mRNA 才能产生足够的抗原水平以进行免疫反应。翻译效率与 Cap1 和翻译起始因子 eIF4E 的亲和力有关。
真核生物基本翻译起始复合体的形成。【3】
免疫原性和不良免疫反应： 第三大障碍是 mRNA 本身可能引发的先天免疫反应，尤其是 dsRNA 或不完整 mRNA。虽然一定程度的免疫激活是刺激适应性免疫系统所必需的，但过度激活会导致炎症反应，从而降低疫苗的有效性或引起副作用。
封盖技术历史
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酶法封端技术： 酶促封端技术在 mRNA 研究的早期就被引入，它涉及使用封端酶（如鸟苷酸转移酶和甲基转移酶）在转录后添加天然 5' 封端。这种方法可确保 mRNA 翻译的高保真度和封端效率，尤其适用于治疗应用。
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合成帽子类似物（1980 年代 - 2000 年代）： 研究人员开发了合成帽类似物，用于体外合成带帽 mRNA，有助于研究 mRNA 功能和基因表达。抗逆帽类似物 (ARCA) 是一种合成帽类似物，旨在防止 mRNA 合成过程中帽子错误插入，提高疫苗和基因疗法中 mRNA 的翻译效率。然而，ARCA 帽的帽化效率和产量较低。
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Cap1 技术（2010 年代）： TriLink 的 Cap1 是一种共转录加帽方法，通过在 mRNA 合成过程中直接加入帽来简化流程。该方法提高了效率，并产生了高比例的正确加帽 mRNA，使其成为 mRNA 疫苗等大规模治疗应用的理想选择。
目前，酶加帽技术在包括 COVID-19 疫苗在内的基于 mRNA 的疗法开发中至关重要，可确保治疗性 mRNA 的稳定性和有效翻译。
下一代酶法封端技术比较 LZCap Capping 和第一代 Capping (ARCA) 方法
开发下一代 Cap 类似物
我们的目标是开发具有抗脱帽酶、高亲和力的 eIF4E 帽类似物以提高翻译效率和降低免疫原性。这些进展对于提高基于 mRNA 的疗法（包括抗癌治疗和基因治疗应用）的有效性至关重要。
设计 LZCap
在设计 LZCap 时，我们主要致力于创建对 eIF4E 具有高亲和力的 cap 类似物。酶对底物的识别相对“特异性”。因此，在设计新的 cap 结构时，我们力求尽可能保持与天然/已知结构的相似性。天然结构具有核糖 3' OH，可以对其进行修饰（例如甲基化）。基于此考虑，我们选择在 3' 位置添加一个碳以增加新颖性，然后添加 NH 以模拟 OH 的氢键，然后添加乙酰基以降低 NH 的碱性并增强其氢键能力。LZCap 的活性优于甲基化的天然 cap，可能是由于增加了氢键。与甲基和甲氧基相比，乙酰氨基也可能增加底物（cap）和起始因子（酶）之间的范德华相互作用。
乙酰氨基的稳定性
乙酰氨基已经足够稳定。它比 7-甲基化位置和磷酸二酯键稳定得多，而后两个位置是帽子中最不稳定的部分。
LZCap 的产量和封盖效率
使用 LZCap AG(3'Acm) 帽，荧光素酶 mRNA 封端效率约为 97.59%，在与 T7 RNA 聚合酶进行的标准体外转录 (IVT) 反应中，1 μg DNA 模板可获得高达 200 μg 的封端 mRNA。简单的 LiCl 沉淀后，mRNA 纯度高达 99%。这种高封端效率和产量使 LZCap 成为各种应用（包括蛋白质生产和基因治疗）的有吸引力的选择。
Cap结构是mRNA疫苗和治疗方法开发的重要组成部分。合成 mRNA 技术依靠 Cap1 来增强稳定性和翻译效率，并减少 Toll 样受体 (TLR) 和其他免疫传感器对 mRNA 的先天免疫识别，从而最大限度地减少不必要的免疫激活。这可以防止不必要的炎症反应，从而提高治疗性 mRNA 在人体细胞中的稳定性和有效性。
| 产品 | 帽 银 (3'-哦我-7mG） | 领智资本 AG(3'Acm) | 银 （无封顶） |
| mRNA产量 （微克） | 164 | 173 | 200 |
采用基于 RNAse H 的方法对 LZCapped Luciferase mRNA 的封端效率进行 MS 分析。封端效率约为 97.59%，
mRNA 对脱帽酶的稳定性如何
含有 LZCap AG(3'Acm) 和 LZCap AG M6 (3'Acm) 的 mRNA 对脱帽酶 (NEB) 表现出更高的抗性。值得注意的是，CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) 也对脱帽酶具有抗性，但常规 Cap AG (3'-OMe-7mG) 不表现出抗性。
LZCap 与 eIF4E 的结合亲和力如何？
LZCap AG(3'Acm) capped mRNA的蛋白表达情况如何？
在不同细胞系* (3T3-L1，Hela，JAWs， HEK293T 和 Huh7) 中 LZCap AG(3'Acm) 加帽荧光素酶 mRNA 的表达量显著高于 Cap1 类似物 (3'-OMe-7mG) 加帽 mRNA，130 次重复实验表明 LZCap AG(3'Acm) 加帽荧光素酶 mRNA 的表达量平均比 (3'-OMe-7mG) 加帽 mRNA 高出约 1.5 倍。在小鼠中也观察到了类似的结果。不同的 mRNA 序列蛋白表达水平可能略有不同。
您有更多的动物数据吗？
LZCap AG(3'Acm)或LZCap AG(3'FMom)的表达效率
与食蟹猴和猪的 CapAG（3'-OMe-7mG）加帽的 mRNA 相比，GLuc 编码 mRNA 在体内表现出更高的表达。
LZCap AG 加帽的 mRNA 的先天免疫原性如何？
LZCapAG ( 3'Acm ) 加帽的 mRNA 表现出较低的先天免疫原性。TLR8、TLR7、IL-1A 和 B 在脱帽 RNA 诱导的免疫反应中起重要作用。LZCapped mRNA 免疫原性分析的体内研究表明，脱帽 RNA 导致小鼠免疫相关因子转录水平发生显著变化。单次 RNA 刺激注射后，LZCap 和 3'-OMe-7mG 加帽的 mRNA 在小鼠体内均显示出类似的较低免疫因子转录水平。
你做过一些安全测试吗？
是的，我们做了细胞毒性试验、人类聚合酶抑制研究和Ames试验。
- 核苷单体3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）在293T、Huh7、MRC5、THP1及U87MG细胞中未观察到细胞毒性或仅有轻微的细胞毒性。
- 人类 DNA 聚合酶 ( α , β , γ 和Klenow)和线粒体RNA聚合酶(hPOLRMT)活性抑制研究表明，3'-Acm-7mG TP不会抑制人类DNA或RNA聚合酶。
- 细菌回复突变试验（Ames）可检测出大多数啮齿动物和人类的相关基因变异以及基因毒性致癌物。Ames 试验表明 3'-Acm-7mG 没有基因毒性。
这个产品有专利吗？
是的。该专利已在美国获得批准。
订购信息
| 产品名称 | 规格 | 目录编号 |
| 领智资本 AG(3'Acm)（ 100毫米） | 100μL，1毫升 | 10684ES |
| 领智资本 AU(3'Acm)（ 100 毫米） | 100μL，1毫升 | 10685ES |
| 领智资本 GG(3'Acm)（ 100毫米） | 100μL，1毫升 | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25毫米） | 100μL，1毫升 | 10688ES |
| 领智资本 AG(3'Ma-Cy7)（ 25 毫米） | 100μL，1毫升 | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 毫米) | 100μL，1毫升 | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-生物素) (25 mM) | 100μL，1毫升 | 询问 |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL，1毫升 | 询问 |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
| LZCap (AG(3'Acm) 萤火虫荧光素 mRNA (1μg/μL) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL，1毫升 | 询问 |
| LZCap(AG(3'Acm)Cas9 mRNA(1μg/μL) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100μL，1毫升 | 我询价 |
参考：
- 冠状病毒RNA加帽和甲基化的分子机制，Virologica Sinica 31(1)
- mRNA疫苗——疫苗学的新时代。 天然药物评论发现。 17, 261–279 (2018)。
- 哺乳动物中 RNA 结合蛋白调控的翻译起始：反式因子、细胞对翻译起始复合物的调节 2021年， 10(7), 1711