HEK293 宿主细胞残留 DNA 片段分析试剂盒专为 定量分析生物制剂中间体、半成品、最终产品中不同长度的HEK293残留DNA片段。本试剂盒采用qPCR荧光探针原理，特异、快速地检测200碱基对以下和200碱基对以上的HEK293 DNA残留，定量限低至10 fg/μL。其中还包含HEK293 DNA Control（DNA定量参考品）。本试剂盒可与本公司基于磁珠的残留DNA样本制备试剂盒（编号：18461ES/18462ES）。

产品信息

成分

储存和运输：

1. 所有组件均在干冰上运输，收到后应储存在 -25°C 至 -15°C 的环境中。保质期为 2 年。组件 A 和 B1、B2、B3 和 B4 应避光保存。

2. 收到后，请检查所有 7 个组件是否存在，并立即将它们存放在建议的温度下。

防范措施：

1. 本产品仅供研究目的使用。

2. 为了安全和健康原因，操作时请穿着实验服和戴一次性手套。

3. 使用该试剂前，请仔细阅读使用说明书。实验应按照标准程序进行，包括样品处理、反应混合物的制备和移液。

4. 使用前应将各成分轻轻摇晃并短暂离心，充分混合。

兼容仪器：

包括但不限于以下仪器： 赛默飞世尔科技：ABI 7500、ABI Quant Studio 5、ABI Step OnePlus， Bio-Rad：CFX96 光学模块， 上海红石医疗科技：SLAN-96S

使用说明

1. HEK293 DNA 对照定量参考的稀释及标准曲线的制备

HEK293片段分析试剂盒包含4个不同长度的扩增片段：82bp、133bp、227bp、515bp，建立标准曲线时，对每个扩增片段分别建立曲线，并根据对应的标准曲线计算其残留量及相对分布。

使用试剂盒提供的DNA稀释缓冲液对HEK293 DNA对照定量参考进行梯度稀释，稀释浓度分别为：3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

详情如下

1）. 将试剂盒中的HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上解冻。完全解冻后，轻轻涡旋混匀并短暂离心（10秒）以收集管底的溶液。

2）.准备六个干净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）。在标有 Std0 的试管中，加入 90 μL DNA 稀释缓冲液和 10 μL HEK293 DNA 对照，以达到 3 ng/μL 的浓度。轻轻涡旋混合并短暂离心（10 秒）。此浓度可分装并储存在 -20°C 下以供短期使用（最长 3 个月）。避免反复冻融。

4）。 在标有 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4 和 Std5 的试管中，首先向每个试管添加 90 μL DNA 稀释缓冲液。每个稀释步骤都应轻轻混合并短暂离心以确保均匀性。 然后进行渐变 稀释如下：

表 1：标准梯度稀释

* 每个浓度重复测定3次，本试剂可检测300 pg/μL~30 fg/μL的线性范围，如有必要可适当扩大或缩小线性范围。

** 为了减少反复冻融循环并避免污染，建议分装并储存 DNA 定量 s首次使用时标准温度为-20°C。

*** 未使用的解冻 DNA 稀释液可在 2-8°C 下保存最多 7 天。如果长时间不使用，请将其保存在 -20°C 下。

**** 为了确保模板完全混合，轻轻摇晃每个梯度稀释液约 1 分钟。

2. 测试样品（TS）的制备

根据实验设置准备测试样品 TS，如下所示：

1) 取100 μL待测样品，加入1.5 mL洁净离心管中，贴上TS标签，进行样品前处理，制备o 普利夫是 測試樣本。

2) 为满足同时分析四种不同延伸长度的要求，预处理后的检测样品量应≥120 μL，因此建议每种样品准备2管进行预处理，萃取后混合使用。

3. 制备阴性提取对照 (NCS)

根据实验设置准备阴性提取控制 NCS，如下所示：

1) 取 100 μL 样品基质溶液（或 DNA 稀释液 缓冲)，加入至1.5 mL干净离心管中，标记为NCS。

2)将阴性对照NCS与该批测试样品一起进行样品预处理，制备纯化的阴性对照NCS溶液。

3) 为满足同时分析四种不同延伸长度的要求，预处理的NCS样品量应≥120 μL，因此建议每种NCS样品准备2管进行预处理，萃取后混合使用。

4. 无模板对照 (NTC) 的制备

根据实验设置准备无模板控制 NTC，如下所示：

1) 无模板对照（NTC）不需要样品 预处理， 并且可以从使用 qPCR 检测残留 DNA 含量的阶段开始准备。

2) 每管或每孔NTC样品由20 μL混合物（即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5 μL 相应的HEK293 Primer & Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer组成。建议准备足够的量用于3个重复孔。

5. qPCR反应体系

桌子 2。 反应体系 为了 82 bp 片段

桌子 3。 反应体系 133 bp片段

桌子 4。 反应体系 2 人份27 bp片段

桌子 5。 反应体系 515 的 bp片段

* 根据孔数计算此反应所需的混合物总量：

混合量 = (反应孔数 + 2) × (15 + 5) μL（以弥补 2 个孔的损失）。通常，每个样品准备 3 个重复孔。

** 反应孔数=（5个浓度梯度标准曲线孔+1个无模板对照（NTC）+1个阴性对照液（NCS）+N个检测样本（TS））×3。

NTC（无模板对照）：DNA 稀释缓冲液

NCS（阴性对照溶液）：样品预处理后的样品基质溶液或DNA稀释缓冲液-治疗 得到纯化溶液，即NCS。

TS（测试样品）：需要测试的样品。

***分配样品并密封试管后，低速短暂离心（10 秒），将液体从试管壁收集到底部。然后涡旋至少 5 秒钟以彻底混合。之后，再进行一次低速离心（10 秒）。如果有气泡，请确保将其去除。

表 6：参考板布局

这个例子 展示s 用于分析残留 HEK293 DNA 扩增片段的 qPCR 检测程序。检测样本包括：HEK293 DNA标准曲线5个浓度梯度，1个检测样本（TS），1个阴性对照液（NCS），1个无模板对照（NTC），建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数（T韓步法） （以 ABI 7500 qPCR 仪器、软件版本 2.0 为例）**

1) 新建一个空白程序，选择“绝对定量”作为检测模板。

2) 针对这四种不同的扩增片段长度，创建新的检测探针，分别命名为“HEK293-82”、“HEK293-133”、“HEK293-227”、“HEK293-515”。报告荧光团选择“FAM”，猝灭荧光团选择“无”。检测的参考染料设置为“ROX”（根据仪器型号等因素，可能添加或不添加参考染料）。

3) 在“Assign target(s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”字段设置为“Standard”，并在“Quantity”字段中分别赋值“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（代表每孔DNA浓度，单位为fg/μL）。在“Sample Name”字段中分别将孔命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”。对于NTC孔，将“Task”设置为“NTC”。对于NCS和TS孔，将“Task”设置为“Unknown”，并在“Sample Name”字段中分别将孔命名为“NCS”和“TS”。设置完这些参数后，点击“Start Run”开始仪器运行。

4)扩增程序设置：设置三步扩增程序，反应体积为30 μL。

桌子7. PCR 程序

7. qPCR结果分析

1）在“扩增曲线”下的“分析”面板中，系统会自动设置“阈值”。有时默认的“阈值”太接近基线，导致重复实验之间的 Ct 值差异较大。您可以手动调整“阈值”到合适位置，然后点击“分析”。此时，您可以初步检查“多组分图”中的扩增曲线是否正常。

2) 在“标准曲线”下的“分析”面板中，您可以读取标准曲线的 R²、扩增效率 (Eff%)、斜率和截距。对于正常的标准曲线：R² > 0.99，扩增效率 (90% ≤ Eff% ≤ 110%)，斜率在 -3.6 和 -3.1 之间。

3）在“分析”面板的“查看孔表”下，可以看到无模板对照（NTC）、阴性对照（NCS）和测试样本（TS）的“定量”栏，单位为fg/μL。单位可以在报告中进行转换。

4）结果分析的参数设置需根据具体的仪器型号和软件版本而定，一般仪器可以自动对结果进行解释。

5)阴性对照（NCS）的Ct值应大于标准曲线最低浓度的平均Ct值。

6) 无模板对照（NTC）的结果应为“未确定”或Ct值≥32。

文档

手动的