想要即時控制裸鼠腫瘤的生長嗎？你想知道小鼠細胞定植的位置嗎？想知道藥物治療對腫瘤的效果 體內？這些可以透過在電池上安裝追蹤器來實現，讓您隨時控制電池的位置和數量。 這項技術就是活體成像「檢測」技術。那什麼是活體成像技術呢？

1.什麼是活體成像技術？
2. 螢光素酶成像的特點
3. 螢光素酶成像的應用方向
4.實驗範例分享
5. 常見問題
6. 產品資訊
7.關於閱讀

1.什麼是活體成像技術？

早在1999年，美國哈佛大學Weissleder博士就提出了分子影像的概念，即利用影像手段在細胞、分子層面上對生物體內的生物過程進行定性和定量的研究。體內成像基於分子成像。透過此影像系統可以觀察活體動物體內的腫瘤生長轉移、傳染病的發展、特定基因的表達等生物過程。

在活體動物體內，活體光學成像主要採用生物發光和螢光兩種技術。生物發光是利用螢光素酶基因來標記細胞或DNA，而螢光技術則是利用綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白等螢光報告基因和FITC、Cy5、Cy7等螢光。用於標記的元素和量子點（QD）。哺乳動物生物發光一般是將螢火蟲螢光素酶基因（由554個核苷酸組成，約50KD）即螢光素酶基因整合到預期觀察細胞的染色體DNA中，以表達螢光素酶。然後培養出能夠穩定表現螢光素酶的細胞株，當細胞分裂、分化、轉移的時候，螢光素酶也會持續穩定表現。基因、細胞和活體動物都可以用螢光素酶基因標記。螢光素酶是一類能催化底物產生生物發光的酵素。不同來源的螢光素酶各有特性，能催化底物發​​出不同顏色的光。其中螢火蟲螢光素酶靈敏度高，線性範圍寬達7~8個數量級。現已成為最常使用的哺乳動物細胞報告基因。將螢光素酶報告質粒轉移到細胞中，並加入其底物螢光素來培養細胞。在 ATP 存在下，O₂和鎂離子作用下，螢光素酶能氧化底物螢光素，產生可見光反應。實現「一次『追蹤器』安裝，隨時追蹤、隨時偵測」。 除了螢火蟲螢光素酶外，有時也會使用海腎螢光素酶。二者的底物不同，前者的底物是D-螢光素，後者的底物是腔腸素。二者的發光波長不同，前者發出的光波長範圍為540-600nm，後者發出的光波長範圍為460-540nm。前者發出的光更容易穿過組織，而後者在體內代謝得更快，且特異性不如前者。因此，大多數體內實驗並未採用螢火蟲螢光素酶作為報告基因。

圖 1.螢光素酶標記細胞的定位

生物發光的光學原理：光在哺乳動物組織中傳播時會發生散射和吸收，光子在遇到細胞膜和細胞質時會發生折射，並且不同類型的細胞和組織對光子的吸收特性不同。血紅素是人體吸收可見光的主要原因，能夠吸收可見光中大部分藍綠色帶的光。但在可見光中大於600nm的紅光波段，血紅素的吸收很小。因此，大量光可以穿過組織和皮膚，在紅色區域中被檢測到。利用活體動物生物發光成像技術可以檢測到至少幾百個皮下細胞。然而，根據小鼠體內光源的深度不同，所能看到的最小細胞數量會有所不同。一般來說，每增加1cm，光強度衰減10倍，富含血液的組織器官衰減較大，鄰近骨骼的組織器官衰減較小。在深度相同的情況下，檢測到的光強度與細胞數量有明顯的線性關係，可以透過儀器量化檢測到的光強度來反映細胞的數量。

圖2. 螢光素酶與螢光素鉀鹽反應發光原理

與生物發光不同，螢光技術是利用螢光報告基因或螢光染料（包括螢光量子點等新型奈米標記材料）進行標記。利用報告基因、螢光蛋白或染料發出的螢光，可以創造體內生物光源。生物發光是動物在沒有激發光源的情況下發出的自發螢光，而螢光則需要經過外界激發光源的激發才可以被成像系統檢測到。螢光標記的用途十分廣泛，包括動物、細胞、微生物、抗體、藥物、奈米材料等。

2. 螢光素酶成像的特點

◎ 無輻射，對生物幾乎無害。

◎ 生物發光無需激發光源。

◎ 靈敏度高，可偵測數百個細胞。

◎穿透性好，3-4cm組織深度仍可偵測。

◎ 信噪比高，螢光訊號強，抗干擾性好。

3. 螢光素酶成像的應用方向

3.1 腫瘤生長

在裸鼠成瘤實驗中，無需侵襲，即時觀察腫瘤生長情況，無需剝離腫瘤進行測量。

3.2 腫瘤藥物

檢測給藥對腫瘤生長或轉移的影響，螢光素底物可在3小時內消除，不干擾藥物實驗。

3.3 細胞定位

檢測了外來細胞在動物體內的定位和分佈。

3.4 基因表現調控

將目的基因或目的基因的啟動子與螢光素酶基因融合，檢測藥物治療過程中或疾病過程中基因表現的變化。

3.5 幹細胞研究

監測幹細胞的移植、存活和增生；追蹤幹細胞的分佈和遷移 體內。

4.實驗 例子 分享

圖 3. 體內 CAR-MUC1治療效果的影像學檢測 T/CAR-MUC1-IL22 T 細胞對腫瘤形成的影響 小鼠^[1]。

圖4. HUC-MSCs細胞注射入小鼠骨骼肌後, 用免疫組織化學法檢測細胞的定位 體內 成像（紅色箭頭標記）^[2]。

圖 5. 的能力 體內 影像學來檢測間質幹細胞（MSC）向燒傷部位的遷移。將間質幹細胞（MSC/FLuc）靜脈注射到小鼠背部燒傷模型。注射四天后，燒傷創面損傷部位出現生物發光訊號，隨後逐漸減弱（紅色箭頭表示燒傷部位）^[3]。

5. 常見問題

Q1：與傳統技術相比，生物發光成像技術有哪些優勢？

與傳統技術相比，該技術在腫瘤轉移研究、基因治療、流行病學、幹細胞示蹤、白血病等相關研究方面比傳統方法具有更高的靈敏度。也可以透過一系列基因改造動物疾病模型快速直觀地研究相關疾病的發病機制及藥物篩選。

Q2：如何用螢光素酶基因標記幹細胞？

可以對組成性表現的基因進行標記，製成基因轉殖小鼠，並對幹細胞進行標記。造血幹細胞取自小鼠的骨髓，並移植到另一隻小鼠的骨髓。此技術可用於追蹤體內造血幹細胞的增殖、分化和遷移。另一種方法是用慢病毒標記幹細胞。

Q3：注射螢光素後多久進行檢測合適，發光可以維持多久？

一般腹腔注射後10-15min螢光訊號達最強穩定期，20-30min後開始衰減。 3小時後，螢光素消除，發光完全消失。

Q4：如何為小鼠注射螢光素？注射方法有什麼差別？

螢光素可透過腹腔注射或尾靜脈注射的方式註射到小鼠體內。約1分鐘即可擴散至小鼠全身。大多數情況下，螢光素的濃度為150mg/kg。 20g的小鼠，可使用約3mg螢光素。用於腹腔注射，擴散慢，起始發光慢，持續發光時間長。對於尾靜脈注射螢光素，其擴散很快，很快就開始發光，但發光持續時間短。

6.產品資訊

Yeasen 是一家從事分子、蛋白質、細胞三大生物試劑研發、生產和銷售的生物技術公司。提供的產品 Yeasen 如下。

表 1. 產品資訊

7.關於閱讀

新一代螢光素酶報告基因檢測系統—更簡單、更靈敏、更精準