1.層黏連蛋白 521 的背景
層黏連蛋白 521 (LN521) 是天然幹細胞微環境內的關鍵細胞黏附蛋白，也是人類胚胎 (hES) 和誘導性多能幹細胞 (hiPSC) 培養和擴增的基質。 LN521 與細胞表面受體結合並活化細胞訊號通路，產生更多功能細胞。
層黏連蛋白521在體外重現了生物學相關的hPSC環境，促進hPSC的附著、高存活率和強的長期自我更新，是支持幹細胞生長、維持基底膜結構和性能穩定性的關鍵基質蛋白。層黏連蛋白521也是最常使用的無營養培養基質之一。此外，Laminin 521無需添加任何凋亡抑制劑可實現遺傳穩定和多能幹細胞的高效單細胞傳代。細胞在均勻的單層中生長，無需手動去除任何分化區域。此外，研究表明，LN521可以支持PSC生長10代以上而無任何核型異常的跡象，並保持了PSC分化為內胚層、中胚層、外胚層三個胚層的能力。
圖 1. 層黏連蛋白 521 結構 [1]
2.層黏連蛋白包被實驗
2.1 用無菌去離子水或註射用水將層黏連蛋白521製備成400µg/ml。建議使用前先以無菌1×DPBS（Ca++/Mg++）進一步稀釋至100µg/ml，再以無菌DPBS（Ca++/Mg++）稀釋至工作濃度5-10µg/ml。包被濃度根據培養細胞的類型而有所不同，建議優化實驗方案以確定細胞的最佳包被濃度。建議濃度請參考表 1。
筆記： 含 Ca 的 DPBS2+ 和鎂2+ 應使用，因為二價陽離子對蛋白質的結構和功能很重要。我們建議初始塗層濃度為 0.5μg/cm2。
表 1. 不同培養容器的重組人層黏蛋白工作溶液的建議體積。
| 培養皿 | 包被濃度（μg/mL） | LN521添加量 | 1*DPBS添加量 | 總體積 |
| 6 好 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 毫升/孔 |
| 12 好 | 5 | 25 μL/孔 | 475 μL/孔 | 0.5 毫升/孔 |
| 24 好 | 5 | 15 μL/孔 | 285 μL/孔 | 0.3 毫升/孔 |
| 四十八 好 | 5 | 7.5 μL/孔 | 142.5 μL/孔 | 150 μL/孔 |
| 96 井 | 5 | 3.5 μL/孔 | 66.5 μL/孔 | 70 μL/孔 |
| 35mm 培養皿 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 毫升/孔 |
| 60mm 培養皿 | 5 | 100 μL/孔 | 1900 μL/孔 | 2 毫升/孔 |
| 100mm 培養皿 | 5 | 300 μL/孔 | 5700 μL/孔 | 6 毫升/孔 |
以上體積基於包被濃度為5μg/mL。
2.2 將規定體積的層粘連蛋白-DPBS 混合物加入每個孔中並輕輕搖晃。確保整個表面都覆蓋有層粘連蛋白塗層溶液，因為未塗層的表面不支持細胞生長。
2.3.將培養板放入 37°C 培養箱中並培養過夜。最短孵育時間為 2 小時，但建議孵育過夜以獲得理想的細胞培養條件。注意不要讓培養容器變乾，這會導致 LN521 失去活性。
2.4.當細胞準備好播種時，吸出層黏連蛋白 521 溶液。
3.iPSC培養
3.1 iPSC解凍（以12孔板為例）
3.1.1 從液態氮或乾冰中取出 iPSC，並在 37°C 水中解凍 10 秒。
3.1.2 用75％酒精對冷凍管進行消毒，並將其轉移到工作檯面上。
3.1.3 將細胞轉移到一個新的含有9 mL DMEM-F12 的15 mL 離心管中。
3.1.4 將15 mL離心管於室溫下以300g離心5分鐘。
3.1.5 從包覆的12孔板中丟棄層黏連蛋白溶液。
3.1.6 棄去細胞上清液，將 iPSC 輕輕懸浮於 1 mL mTeSR-plus（含 10 µM Y-27632）中，然後將其轉移至包覆的 12 孔板中。搖晃培養板，使細胞均勻分佈，最終細胞密度為 1×10^5 細胞/孔，室溫靜置 10 分鐘。確保培養物在4-5天內傳代。
3.1.7 將12孔板放回37℃培養箱培養。
3.1.8 含ROCK抑制劑的培養基應於12～16小時後棄去，並在不含抑制劑的培養基中繼續培養。
表2. 不同培養容器中細胞接種密度，依細胞生長速度決定細胞數量
| 細胞培養容器 | 6 好 | 12 好 | 24 好 | 96 井 |
| 細胞數量 | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
3.2. iPSC 傳代方案
3.2.1 棄去培養上清，用 1 mL PBS（Ca‑‑/毫克‑‑）。
筆記： 使用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，因為二價陽離子會對某些解離酶產生負面影響。
3.2.2 棄去 PBS，加入 0.5 mL 溫和細胞解離試劑。在室溫下孵育 6-8 分鐘或在顯微鏡下觀察，直到細胞不再結合在板上。
3.2.3 加入等體積的DMEM-F12，輕輕混勻細胞，轉移至室溫離心管中，300g離心5分鐘。
3.2.4 在傳代細胞之前，準備一個層黏連蛋白包被的12孔板。
3.2.5 棄去上清液，將細胞懸浮在含有 10 µM Y-27632。
3.2.6 將細胞轉移至準備好的層黏連蛋白包被的12孔板中。輕輕搖晃培養皿以使細胞均勻分佈，並在室溫下放置 10 至 20 分鐘。
3.2.7 將12孔板放入37℃培養箱中培養。
筆記： iPSC 長成單層後會迅速分化並死亡。為了保持生長和多能性，它們需要在匯合之前進行傳代。
3.3. iPSC 的冷凍保存
3.3.1 配製溫和細胞解離試劑。
3.3.2 依照iPSC傳代方案進行細胞分離，透過細胞器計數確保凍存前細胞密度。
3.3.3 每管細胞凍存密度應為1-2×10^6。按照 iPSC 傳代協議中的離心和去除細胞培養基的步驟進行。將分離的 iPSC 沉澱物重新懸浮在適當體積的冷凍保存溶液中
3.3.4 將1 mL重懸後的細胞凍存沉澱物加入1.5 mL凍存管中，程序降溫，然後轉入液態氮中長期保存。
4. 層黏連蛋白塗層的重要注意事項
4.1.實驗方案中的所有步驟都必須在無菌條件下進行。
4.2.避免將層黏蛋白長時間暴露在室溫下。
4.3.避免反覆凍融
4.4.解凍後未稀釋的蛋白原液在2~8℃無菌條件下保存，穩定保存至少3個月。
5.相關產品訊息
| 產品名稱 | 貓＃ | 尺寸 |
| 92602ES | 10微克/100微克/500微克/1毫克 |
6.參考文獻
[1]Pulido D、Briggs DC、Hua J、Hohenester E. 層粘連蛋白β2短臂的晶體學分析揭示了LF結構域如何插入到規則排列的LE結構域中。基質生物學。 2017 年 1 月；57-58：204-212。