精確點突變檢測的 PCR 方法 - ARMS

隨著醫學研究的不斷進步，標靶治療也愈加成熟。標靶治療的前提是對藥物的分子標靶進行基因檢測，以識別導致遺傳性疾病或惡性腫瘤的基因突變。 ARMS-PCR 是一種基於 PCR 的新方法，可檢測大量 DNA 點突變。它是目前癌症定制基因識別最重要和最普遍的方法之一。其治療用途的益處已獲得該領域專家的充分認可。

1. 等位基因特異性 PCR 如何運作？
2. 如何提高ARMS的特異性？
3. 提供的產品有哪些特色？ Yeasen？
4. 產品性能數據有哪些？
5. 人們如何訂購產品？

1. 等位基因特異性 PCR 如何運作？

ARMS-PCR是擴增阻斷突變系統PCR（ARMS-PCR），也稱為等位基因特異性PCR（AS-PCR）。調控等位基因特異性延伸，辨識野生型等位基因及突變野生型基因，並利用Taqman探針技術測量螢光訊號值。
ARMS PCR引子設計為在等位基因的兩個上游引子的3’端有不同的核苷酸，這兩個引子分別針對野生型和突變型。擴增過程中，與模板不完全匹配的上游引子不能形成互補的鹼基對，造成錯配，延伸受阻，不能產生PCR產物；而與模板完全匹配的引子系統則能擴增出對應的PCR產物。 Taqman 探針上的螢光團可能發出可被裝置偵測到的螢光訊號，透過評估螢光數據可以驗證基因型。
ARMS技術靈敏度高，檢測極限可達100拷貝/mL，腫瘤組織的檢測極限可達到0.5%的突變率。此外，ARMS耗時短、成本低，結果直覺且易於判斷。這是因為ARMS與qPCR或電泳技術結合，只需要一次PCR反應，耗時更少。 ARMS技術只需要對上游引子進行最佳化，與使用MGB探針的即時PCR技術相比，成本更低，結果直觀。由於從石蠟包埋的組織標本中提取的DNA大部分是碎片化的，無法得到準確的檢測結果。 ARMS 方法旨在盡量縮短目標產品的長度，從而解決石蠟包埋組織中的這種困難。同時ARMS結合PCR平台實現閉管操作，操作簡單，無需產物後處理，最大程度避免了擴增產物的污染。
理論上，Taq DNA聚合酶必須與引子3'端的剩餘模板完全互補才能進行有效的聚合。然而，Taq DNA 的嚴格性受多種因素影響。在某些情況下，即使引子的 3' 末端鹼基與模板不互補，延伸仍可進行。若3’端僅有一個鹼基錯配，引子可以錯配延伸，但延伸效率較低。不同的3'端位錯有不同的延伸效率。若在3’端引入其他錯配的鹼基，則錯配的數量過多，3’端無法延伸到一定程度。因此，引子 3' 端僅有一個鹼基錯配無法充分區分兩個等位基因，導致假陽性結果。

2. 如何提高ARMS的特異性？

提高ARMS特異性的重點是提高引子延伸特異性。錯配的鹼基可能出現在 3' 端起第 2 或第 3 個鹼基處。錯配的鹼基與3’端錯配的鹼基共同作用，在3’端不互補的模板中，導致引子擴增產物率降低。雖然引子在與其 3' 端互補的模板中正常擴增，但引子的錯配鹼基類型取決於 3' 端鹼基錯配的類型。
設計好針對ARMS的特異性引子後，需要一對用於等位基因特異性螢光共振能量轉移的TaqMan探針。 TaqMan探針有兩種螢光染料，5’端是螢光基因，3’端是一般的螢光猝滅基因。在完整的探針中，猝滅基因和螢光基因在空間上非常接近，導致螢光猝滅。正常情況下，5'端螢光團發出的螢光是無法偵測到的，只能偵測到3'端猝滅劑的背景螢光。在目標基因擴增過程中，PCR引子和螢光標記的探針在去OR時都會與目標序列互補。當Taq酶在延伸模板鏈時遇到與模板穩定結合的探針時，Taq酶的5'-3'外切酶會降解與模板結合的特異性探針。探針上的螢光團被物理空間隔開，猝滅效應消失，發出螢光。弱螢光探針和目標序列之間的不匹配會減少釋放的螢光量。