Ct值是螢光定量PCR中一個重要的結果表徵。它用於計算基因表現水平或基因拷貝數的差異。那麼，螢光定量時Ct值什麼範圍才算是合理的呢？如何確保Ct值在有效範圍內？今天就讓小易來為大家解答這個問題吧。
Ct值是什麼？
qPCR擴增過程中，Ct值是指擴增產物螢光訊號達到設定的螢光閾值的擴增循環數（Cycle Threshold）。 “C”代表週期，“T”代表閾值。簡單來說，Ct值就是qPCR中起始模板達到某一產物量所需的循環數，後面會進一步解釋。
Ct值起什麼作用？
1. 指數擴增、模板量和Ct值之間的關係
在理想情況下，在 qPCR 過程中，基因會呈指數擴增並在一定數量的循環內累積。擴增循環數與產物量的關係可表示為：擴增產物量=起始模板量×（1+En）^循環數。然而，qPCR 反應並不總是在理想條件下發生。當擴增產物量達到「一定的產物量」時，此時的循環數即為Ct值，表示指數擴增的週期。 Ct值與起始模板量的關係為：某模板的Ct值與該模板起始拷貝數的對數呈線性關係。初始模板濃度越高，Ct 值越低，反之，初始模板濃度越低，Ct 值越高。
2.擴增曲線、螢光閾值及一定的產物量
qPCR擴增產物的數量直接以螢光訊號的形式表示，即擴增曲線。在 PCR 的早期階段，當擴增處於理想條件下且循環數較低時，產物的累積很少，產生的螢光水平與背景螢光雜訊沒有明顯區別。隨後，螢光的產生進入指數期。當反應剛進入指數期時，某一時刻可以偵測到PCR產物的量，稱為「某一產物量」。這可以用來推斷模板的初始內容。因此，對應於某一產物量的一個螢光訊號強度稱為螢光閾值。
在PCR的後期，擴增曲線不再呈指數擴增，進入線性期和平台期。
3.Ct值的重複性
當PCR循環數達到Ct值所出現的循環數時，才進入真正的指數擴增階段。此時，微小的誤差還未被放大，因此 Ct 值的重現性極佳。這意味著無論同一模板在不同時間擴增，或是同時在不同管中擴增，所獲得的Ct值都保持恆定。
Ct 值的範圍是多少？
1.擴增效率En
PCR擴增效率是指聚合酶將目標基因轉化為擴增產物的效率。當一個DNA分子轉換成兩個DNA分子時，擴增效率為100％。放大效率通常表示為En。為了方便後續文章的分析，這裡對影響擴增效率的因素做簡單的介紹。
| 影響因素 | 解釋 | 判決 |
| A. PCR 抑制劑 | 1. 模板RNA可能含有抑制PCR反應的物質，例如蛋白質或去垢劑等。 2. 逆轉錄後所得的cDNA中可能含有高濃度的模板RNA和逆轉錄試劑的成分，也可能抑制後續的PCR。 | 1. 可以透過測量 A260/A280 和 A260/A230 比率或進行 RNA 電泳來評估是否有污染。 2. 反轉錄後cDNA是否以一定比例稀釋。 |
| B.引子設計不合理 | 底漆無法有效退火。 | 檢查引子是否有二聚體、髮夾結構，以及是否有錯配；有時需要注意跨內含子的設計。 |
| C.反應程序不適宜 | 1. 引子無法有效退火。 2.DNA聚合酶活性未充分釋放。 3.由於長時間高溫，DNA聚合酶活性降低。 | 1. 退火溫度高於引子的Tm值。 2.預變性時間太短。 3. 反應方案中每個階段持續時間太長。 |
| D.試劑混合不充分或移液錯誤 | 反應體系中PCR反應組分局部濃度過高或不均勻，導致PCR無法達到指數擴增。 | / |
| E.擴增子長度 | 擴增子長度太長，超過300個鹼基對，導致擴增效率低。 | 檢查擴增子長度是否在80個鹼基對至300個鹼基對之間。 |
| F.qPCR試劑的影響 | 試劑中 DNA 聚合酶濃度較低或緩衝液中離子濃度不理想會導致 Taq 酶無法達到其最大活性。 | 標準曲線用於測量引子的擴增效率。 |
2.Ct值範圍
Ct值範圍是15-35。 Ct 值小於 15 被認為處於基線階段，尚未達到螢光閾值。理想情況下，Ct值與模板初始拷貝數的對數呈線性關係，即標準曲線。利用標準曲線，在擴增效率為100%的情況下，計算出定量單一基因拷貝的Ct值在35左右，如果Ct值大於35，理論上模板的初始拷貝數小於1，可以認為沒有統計意義。
對於不同的基因，由於起始模板基因拷貝數以及擴增效率的不同，其Ct值範圍也存在差異，因此需要建立該基因的標準曲線，來計算該基因的線性檢測範圍。
3.影響 Ct 值的因素
由擴增循環數與產物量的關係可知：擴增產物量=起始模板量×（1+En）^循環數，可見在理想條件下，起始模板量與En都會影響Ct值。模板品質或擴增效率的差異會導致Ct值過高或過低。
4. Ct值過高或過低
肖毅請教了我公司技術部的專家，對兩類常見的Ct值問題的原因及解決方法進行了總結，希望對大家有所幫助。
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
| Ct 值過高 | 模板濃度低或存在 PCR 抑制劑。 擴增效率低。 | 1.增加模板濃度；或增加RNA或cDNA的稀釋比例；或重新準備模板。 2.降低退火溫度，或採用兩步驟擴增方法；確保組件和系統充分混合；優化反應方案；或嘗試更換試劑。 |
| Ct值過低 | 1. 模板濃度高 2. NTC（無模板控制）和NRC（無反向控制）中的污染 3. 引子設計不合適 | 1.減少模板RNA的量；或以更高的比例稀釋 cDNA。 2. 重新更換所有試劑；或使用UDGase抗污染試劑。 3. 優化程序，避免非特異性擴增。 |
至此，該問題Ct值異常的原因分析完畢。接下來小易就推薦一系列高性價比的產品，確保你的實驗數據更準確可靠。快來挑選你最喜歡的吧！
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