螢光定量PCR（qPCR）是實驗室常用的技術，可應用於基因表現分析、基因分型、病原體檢測、SNP分析等。 qPCR操作簡單，原理易於理解。現在，面對一堆雜亂的數據，如何分析結果就成了一項艱鉅的任務。今天小毅就來指導大家如何將複雜的流程簡化，輕鬆取得可以發表SCI期刊的數據！
qPCR中常用的分析方法有相對定量和絕對定量，這些方法的選擇應根據不同的實驗設計而定。本期我們主要討論qPCR的一個常見應用－基因表現分析，其中一般選擇相對定量的方法。
實驗設計
假設我們目前需要研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表現的影響。對照組為未經過任何處理的擬南芥植物，實驗組為某種光誘導處理的植物。從兩組中提取 RNA，然後逆轉錄以獲得 cDNA，然後將其用作模板。擬南芥 GAPDH 基因將被選為 qPCR 實驗的內部參考。
需要設定的qPCR孔如下：
1） 負溫度係數 (NTC) （無模板對照）用於驗證PCR體系中是否有污染。
2） 尼古丁替代療法 （無反轉錄）是指使用沒有經過逆轉錄的RNA作為模板，作為gDNA污染的控制。
3） 內參基因 用於校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。
4）選擇 對照樣品 一般分為以下幾類：
- 為了評估某種處理對基因表現的影響，未處理的樣本被用作參考樣本。
- 為了檢測不同時間基因表現的差異，以時間0的樣本作為參考樣本。
- 為了比較不同組織之間基因表現的差異，任意選擇一個組織作為參考樣本。
這裡要注意的一點是，上述的每種材料都設置了3個PCR孔（1、2、3）。這些是 PCR 重複，也稱為技術重複，旨在消除操作錯誤並準確評估擴增效率。此外，還需要建立生物學重複，即對不同的材料（不同時間、植物、批次、反應板）進行相同的實驗，以校準生物變異性並分析處理是否具有統計意義。具體在這種情況下，實驗組和對照組都需要至少兩組擬南芥樣本（A，B，C）進行處理。從每組中提取 RNA 並逆轉錄，然後進行 qPCR。對於統計分析，使用三個生物學重複的平均值。
結果分析—ΔΔCt方法
ΔΔCt法的特徵是單純依賴Ct值來計算，但前提是目的基因與內參基因的擴增效率要相對一致，且均在90-110%範圍內。
具體計算公式如下：
ΔCt = Ct（目標基因）-Ct（參考基因）
ΔΔCt = ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）
RQ = 2^(-ΔΔCt)
假設上述實驗研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表現的影響，qPCR的結果如下：
在計算的時候，我們先計算對照組的2^-△Ct數據的平均值（如上圖所示，為0.00116）。然後，我們將每個2^-△Ct的值除以這個平均值，得到2^-△△Ct的值。最後將這些數值整理，得到平均值和標準差，顯示實驗組目標基因的表達量相對於對照組提高了約9.73倍。
使用Graphpad軟體繪製結果如下：
軟體的t檢定計算出的P值為0.0024，小於0.05，表示差異具有統計意義，結果可靠。
結果分析—雙標準曲線法
在實際應用中，由於目的基因與內參基因的擴增效率往往不同，因此需要重新設計引子、優化反應條件，才能達到相同的擴增效率。不過，我們也可以選擇更方便的方法，即雙標準曲線方法。
這裡我們先來了解絕對量化的分析方法。具體步驟是透過PCR擴增出目的片段，然後將目的片段插入克隆載體中，提取重組質粒，經定序確認正確後即可作為標準。可以使用Nanodrop等儀器測量質粒DNA的量，並使用拷貝數轉換公式將拷貝數轉換為特定的質粒拷貝數。此後，DNA經過一系列稀釋後擴增。以標準拷貝數的對數為 x 軸、以測得的 Ct 值為 y 軸繪製標準曲線。根據未知樣本的Ct值，可以計算出其絕對拷貝數。
拷貝數計算公式：
拷貝數 = (質量÷相對分子質量) × 6.02 × 10^23
雙標準曲線法是針對目標基因和參考基因分別建構標準樣本，進行絕對定量，並繪製標準曲線。計算出未知樣本的絕對拷貝數後再進行比較，從而提供更高的準確度。
具體計算公式如下：
Q = 目標基因拷貝數/參考基因拷貝數
RQ = Q（實驗）/Q（控制）
在上述研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表現影響的實驗中，分別建構了AtSUC2和GAPDH的標準樣品，並製作了以下標準曲線：
待測樣本中目的基因與內參基因的Ct值如下：
計算時，先將目的基因和內參基因的Ct值代入標準曲線的線性關係，得到實驗組和對照組中目的基因和內參基因的絕對拷貝數。再利用公式Q=目標基因拷貝數/參考基因拷貝數，將目標基因的表現量標準化。最後根據公式RQ=Q(實驗)/Q(對照)計算RQ為9.71，顯示實驗組目的基因表現量比對照組高出9.71倍。
使用GraphPad軟體繪製的結果如下：
此軟體t檢定計算出的P值為0.0008，小於0.05，表示差異具有統計意義，結果可靠。
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