成熟的miRNA長度只有20nt左右，通常正向引子會覆蓋其全長甚至會有多餘的部分，而反向引子則無處放置。目前市面上的解決方案是在逆轉錄的時候增加逆轉錄產物的長度。常見的方法有加尾法、莖環法等。

1. 簡介
2. 產品推薦
3. 相關產品列表

1. 簡介

微小RNA（miRNA）是一類大小約21~23個鹼基的單鏈小RNA，是由長約70~90個鹼基的具有髮夾結構的單鏈RNA前體經Dicer酶加工後生成的。 miRNA主要特異性地與標靶基因mRNA的3’端非編碼區結合，調控轉錄後標靶基因mRNA的翻譯過程，進而阻礙mRNA翻譯、促進mRNA降解，導致蛋白質表現量下降。 miRNA的作用參與個體發育、組織分化、細胞增生、凋亡等多種心血管疾病的發生、發展。

圖1. miRNA在體內合成示意圖

成熟的miRNA長度只有20nt左右，通常正向引子會覆蓋其全長甚至會有多餘的部分，而反向引子則無處放置。目前市面上的解決方案是在逆轉錄的時候增加逆轉錄產物的長度。常見的方法有加尾法、莖環法等。

圖2. 加尾法合成miRNA

圖 3. 透過莖環法合成 miRNA

加尾法是利用PolyA聚合酶為成熟的miRNA添加Poly（A）尾巴，以帶有通用序列的Oligo-dT作為逆轉錄引子，合成與cDNA第一鏈相對應的加長miRNA。莖環法利用折疊成莖環結構的通用序列作為引物，合成延長的miRNA對應的cDNA第一鏈。莖環結構將在隨後的擴增過程中在適當的溫度下打開 並與相應的擴增引子結合。

表 1.尾部結構和莖環結構的比較

2. 產品推薦

2.1 Yeasen miRNA尾部倒置定量組合（11148ES&11171ES）

圖4.11148ES-Hifair™ miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒

本試劑盒以加尾法對miRNA第一鏈cDNA進行逆轉錄。產品中的2×Hifair™ miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應和逆轉錄反應的全部原料和引物，並經過精心優化。它可以確保miRNA 3'端的poly(A)修飾和逆轉錄過程同時高效地進行。

圖 5. 11171ES -Hieff™ miRNA 通用 qPCR SYBR 預混液

專門針對miRNA定量檢測研發的新一代預混螢光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用於所有qPCR儀器，不同儀器上無需調整ROX濃度，只需在製備反應體系中加入引子和模板即可擴增。 DNA聚合酶採用化學改良的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使得反應特異性和靈敏度更高，並能在更寬的範圍內準確定量。

2.2 產品性能

2.2.1 相容全平台qPCR儀器

圖 6. 不同 qPCR 儀器的兼容結果

以293T細胞總RNA為模板，以Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）進行逆轉錄。將所得的cDNA稀釋10倍，然後使用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）分別檢測hsa-miR-let-7b-5p，hsa-miR-let-7c-5p和U6的內參基因。

2.2.2 偵測率高，可達10 pg

圖 7. 擴增圖

圖 8. 擴增圖

以合成的hsa-miR-let-7e-5p（a）和293T細胞Total RNA（b）為模板，分別稀釋成60拷貝～606拷貝（6個梯度）和10 pg～100 ng（5個梯度），用Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cefffal™Hix11421111142111421114222421132， # 11171ES）檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表現。

2.2.3 特異性強，能夠區分同一家族中miRNA之間的單一鹼基差異

圖9. 區分miRNA之間的單一鹼基差異

人類hsa-let-7家族有多個miRNA，彼此之間很少有鹼基差異，甚至只有一個鹼基的差異。使用 Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 將合成的每種 Let-7 異構體 (hsa-miR-let-7a~Let-7i、has-miR-98) 的 miRNA 逆轉錄為 cDNA，使用 Hieff™ Universal qPCR 增本 (1212)12 x212 x212 x215)12123 miRNA 12121297123)。 100% 計算匹配率。結果表明，密切相關的亞型家族成員能夠被有效區分。

2.2.4 優異的擴增效率

圖10. 擴增效率

圖 11. 擴增效率

以人類293T細胞及小鼠肝臟總RNA為模板，擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結果顯示，與同類產品相比，Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）與Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）反應體系匹配性優異。

2.2.5 穩定性優良

圖12. 37℃7天產品穩定性分析

圖13. 50次凍融循環後結果分析

圖14 定量反應體系在不同溫度下24h穩定分析特性

以293T細胞總RNA為模板，以Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）進行逆轉錄，將所得cDNA稀釋10倍後以Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）進行檢測。 hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p 的表達。 △Ct<0.5。

2.3 Yeasen miRNA莖環倒置定量組合（11139ES&11170ES）

圖 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA 合成試劑盒（gDNA digester plus）

本試劑盒基於 Hifair™ III 逆轉錄酶開發。此酵素cDNA合成速度快，且熱穩定性大大提升。同時此酵素增強了與模板的親和力，適合少量模板和低拷貝基因的逆轉錄。 Hifair™ III 逆轉錄酶合成全長 cDNA 的能力也得到了提高，允許合成長達 19.8 kb 的 cDNA。

圖 16. 11170ES-Hieff™ miRNA 通用 qPCR SYBR 預混液

本產品為採用SYBR Green I嵌合螢光法進行miRNA定量的專用master mix。由於miRNA序列較短，且同一家族中的miRNA序列往往高度相似，因此定量時極度要求特異性。本產品基於熱啟動DNA聚合酶，搭配優化的Buffer，可大幅減少非特異性擴增；同時特製的ROX Reference Dye使得master mix適用於所有的qPCR儀器，在不同儀器上無須調整ROX，只需在製備反應體系時添加引子和模板即可進行擴增。

2.3.1 相容全平台qPCR儀器

圖 17. 不同 qPCR 儀器的相容結果

以小鼠肝細胞總RNA為模板，以Hifair™ III 1st Strand進行逆轉錄
cDNA合成試劑盒（gDNA digester plus）（Cat#11139ES），將所得的cDNA稀釋40倍後採用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11170ES）擴增人類mmu-miR-125a基因。

2.3.2 靈敏度高，可達10 pg

圖 18. 靈敏度檢測

以小鼠肝細胞總RNA為模板，以Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)進行逆轉錄，將所得的cDNA進行10倍梯度稀釋（範圍10pg/μL）。 -0.1 μg/μL)，擴增鼠來源的 mmu-miR-125a、mmu-miR-132 和 mmu-miR-351 基因。

2.3.3 特異性強，能夠區分同一家族中miRNA之間的單一鹼基差異

圖19. 區分 miRNA 之間的單鹼基差異

人類hsa-let-7家族有多個miRNA，彼此之間很少有鹼基差異，甚至只有一個鹼基的差異。使用 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別以不同的引子擴增這些 miRNA，並使用公式 2^-Δct x 100% 計算匹配率。

2.3.4 重複性好

圖 20. 重複性檢測

以人類293T細胞Total RNA為模板進行逆轉錄，以Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)進行逆轉錄，將所得的cDNA稀釋50倍後採用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170倍後以Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11702)。

2.3.5穩定性好

圖 21.11170ES在不同溫度下14天的穩定性分析

圖 22. 11170ES 反覆凍融分析

圖23 定量反應體系在不同溫度下24h穩定分析特性

以小鼠肝細胞總RNA為模板，以Hifair™III第一鏈cDNA合成試劑盒（gDNA digester plus）（Cat#11139ES）進行逆轉錄。將所得的cDNA稀釋100倍以擴增小鼠mmu-miR-132基因。

3. 相關產品列表

Yeasen 生技（上海）有限公司成立於2014年，是一家從事工具酵素原料及抗原抗體研發、生產的高新技術企業。其產品包括用於醫藥、食品安全檢測、育種、司法等產業的分子診斷酵素、蛋白質和抗體。我們致力於為生命科學領域的客戶提供高品質的產品和服務。相關產品由 Yeasen 如下：

表2. 相關產品列表