優化工業生產和自我擴增mRNA的淨化

儘管mRNA技術在疫情期間取得了良好的效果並展現出巨大的潛力，但它仍然存在表達時間短、蛋白質翻譯有限等限制。雖然這些特點可以提供一定程度的安全性，但它們成為蛋白質替代等療法的限制。這需要重複給藥以維持蛋白質表現水平，從而引入了新的風險和挑戰，例如免疫原性和中和抗體。

自擴增 RNA（saRNA）可以以比傳統 mRNA 小數百倍甚至數千倍的劑量產生相同的免疫反應。較低的劑量意味著較低的生產成本，而較少的注射頻率可以減少 mRNA 和遞送載體的潛在副作用。目前，已有多種saRNA候選物進入全球臨床試驗。 BioNTech等大公司正積極開發saRNA技術管道。

儘管saRNA具有顯著的成本和安全優勢，但其獨特的結構帶來了新的生產挑戰。 saRNA分子將編碼RNA聚合酶的序列與目標蛋白質序列結合在一起，比傳統的mRNA大得多（約10kb）且更複雜（包含更多的二級結構）。這大大增加了體外轉錄反應的難度，降低了saRNA的產量和純度。因此，saRNA的生產對合成、分離和純化過程的要求更高。

親和層析法是一種分離純化的方法，有目標產物產量低、完整性低等問題。結合多種色譜純化方法（例如添加纖維素色譜、疏水反相層析）比較麻煩，會引入新的雜質，回收率低，而且成本高。此外，用於大規模生產的IVT反應體係是從適合合成100nt核酸序列的系統優化而來的，不適用於超過10kb的saRNA。這就需要優化現有的IVT反應系統。目前常規的mRNA純化方法無法滿足工業原液品質要求。因此迫切需要開發和優化一套完整、高效的工業級自擴增RNA分離純化製程。

工業生產和純化方法的最佳化

為了開發自擴增mRNA（saRNA）的工業生產系統，必須先在小規模上優化IVT共轉錄系統中的緩衝離子類型和組成。這也涉及改進色譜緩衝液和樣品清洗比例，以用於下游純化過程。這些優化條件隨後可以擴大到大規模生產，以驗證該系統是否能夠有效提高生產能力並改善原料產品的品質。

共轉錄加帽反應體系

在共轉錄加帽反應體系中，T7緩衝液成分包括400mM HEPES，20mM亞精胺，100mM DTT，Mg2+鹽。

T7緩衝液-鎂離子鹽型

所使用的鎂離子鹽的類型會影響目標 saRNA 產品的產量和完整性。

1. 對於1mg mRNA的小規模共轉錄合成，使用Mg(OAc)2作為Mg2+鹽可獲得最佳的產量和完整性，分別為100.5µg和62.9%。
2. 相較之下，使用其他鎂離子鹽如MgCl2和MgSO4會導致產量降低約25-50%，完整性降低約10%，顯著降低產量和完整性。

T7 緩衝液 - 鎂離子濃度

乙酸鎂離子的最佳濃度（30-50mM）可提高目標saRNA的產量和完整性，其中35mM時效果最佳。

1. 當醋酸鎂離子濃度為30-50mM時，saRNA產量達88.5-100.5µg，完整性為58.6-62.9%，顯示出良好的結果。
2. 濃度為35mM時產量和完整性最高，分別達100.5µg和62.9%。

T7緩衝液-鎂離子鹽與其他鹽類的結合

在T7緩衝液中添加其他鹽可以顯著提高目標產品的產量和完整性。

1. 基礎 T7 緩衝液包括 400mM HEPES、20mM 亞精胺、100mM DTT 和 Mg2+ 鹽，產量和完整性分別為 100.5µg 和 62.9%。
2. 添加第二種鹽 NaOAc 可進一步提高產量和完整性：產量增加 20-110µg，完整性提高約 2-8%。

T7 緩衝液 - 組合鹽濃度

當第二種鹽組分NaOAc（Na+）濃度為5-30mM時，目標saRNA的產量和完整性顯著提高，最佳濃度為15mM。

1. 在Na+濃度為3-30mM時，saRNA產量可達120-210µg，完整性為64.4-70.2%，顯示出良好的結果。
2. 當Na+濃度為15mM時，產量和完整性最高，分別達210µg和70.2%。

單一純化方法

在小規模（<50mg）saRNA生產純化過程中，使用不同的純化方法可以顯著降低dsRNA含量和蛋白質殘留，確保高產量、封端效率和產品完整性。純化方法的效果由好到壞依序為：親和層析>氯化鋰沉澱>超濾、纖維素層析。

1. 親和層析

對於大規模 mRNA 生產，色譜法是首選。選項包括反相層析、離子交換層析、疏水色譜和親和色譜，每種色譜都有其優點和缺點。親和層析法通常用於捕捉 poly(A) mRNA，可提供可擴展性和平台解決方案，回收率 >90%。

mRNA 的關鍵結構特徵，5' 帽和 3' poly(A) 尾，有助於純化。親和層析類似於磁珠純化，使用 dT 連接的珠子來捕獲 poly(A) 尾 mRNA。高鹽條件屏蔽了負電荷，允許透過 AT 氫鍵結合，並且 mRNA 在溫和的中性 pH 值和低電導率下被洗脫。

RNA 親和層析涉及「高鹽結合、低鹽洗脫」。緩衝液成分、分子大小、溫度和樣品濃度對此過程有顯著影響。透過實驗選擇最佳的鹽類型和濃度對於有效淨化至關重要。

純化：此方法產品完整度最高（80.3%）、dsRNA含量最低（0.01µg/mg）、封端效率最高（96.4%）、蛋白殘留量最少（1.20µg/mg），產量136µg，回收率為65%，產品純度及品質最優。

2. 其他淨化方法：

氯化鋰沉澱

使用LiCl純化mRNA的原理是，在一定的pH值下，鋰可以降低分子間的靜電排斥，進而實現RNA高效沉澱。然後透過離心分離沉澱物，溶解以獲得純的 RNA 樣本。 LiCl 沉澱方法簡單、快速、對各種大小的 mRNA 都有效，且能獲得高純度的產物。然而，殘留的鋰離子會抑制mRNA。建議對含有至少400 µg/ml RNA 的溶液使用 LiCl 沉澱，以確保純化效率。 此方法產量較高（210µg），但產品完整性僅70.2％，大大降低了產品品質。不適合大規模生產。

磁珠法：

磁珠是在磁場下定向移動的小顆粒，通常由氧化鐵核心和外部塗層組成。磁珠純化是一種常見的分子生物學技術，可快速有效地從混合物中富集 mRNA 分子。不同功能磁珠具有不同的表面功能基（如羥基、羧基、Oligo(dT)、鏈黴親和素），用於純化各種生物分子。

羧基化磁珠可以有效純化核酸，在酸性條件下透過靜電交互作用與mRNA分子結合。調整條件可以實現 mRNA 的選擇性結合和釋放。較長的 mRNA 具有更多暴露的帶負電荷的磷酸基團，因此更容易與珠子結合。對於較短的 mRNA，可能需要較大的珠子體積。 Oligo(dT) 偶聯磁珠與親和層析類似，利用 mRNA 的 poly(A) 尾與磁珠的 Oligo(dT) 之間的特定結合。

超濾

此方法導致saRNA完整性最低，比親和層析低約8%，蛋白質殘留量最高（4.58µg/mg）。

纖維素色譜法

此方法實現了較低的 dsRNA 含量 (0.009µg/mg) 和較高的封端率 (96.4%)。但蛋白質殘留量略高（5.30µg/mg），回收率僅57%，產量為120µg，均明顯低於親和層析法的產量（分別約10%及16µg）。

淨化過程

色譜緩衝液成分-添加還原劑

在純化過程中在層析緩衝液中添加還原劑，與不添加還原劑相比，可顯著提高產品完整性、回收率和封端效率，同時降低副產物dsRNA和蛋白質殘留物的含量。

1. 未使用還原劑：

- 產量：136µg

恢復率：65％

- 誠信度：80.3%

- 雙股RNA：0.01µg/毫克

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：1.20µg/mg

- 產品純度和品質良好。

2. 使用還原劑（TCPE、DTT、β-巰基乙醇）：

- 產量增加10-40µg

- 恢復率增加5-18％

- 完整性提高約 1-5%

封蓋效率：96.4％

- dsRNA：低至 0.005µg/mg

- 蛋白質殘留量：低至0.20µg/mg

- 產品純度和品質顯著提高。

色譜緩衝液成分 - 還原劑類型

在層析緩衝液中添加不同類型的還原劑，可進一步提高產品完整性、回收率和封端效率，同時減少dsRNA和蛋白質的殘留。 TCPE 被發現是最有效的還原劑。

- 使用 TCPE：

- 產量：175µg

恢復率：83％

- 誠信度：85.2%

- 雙股RNA：0.005µg/毫克

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：0.20µg/mg

- 卓越的產品純度和品質。

色譜緩衝液成分-還原劑濃度

在層析緩衝液中添加5-15mM濃度的還原劑，可顯著提高產品完整性、回收率、封端效率，同時減少dsRNA和蛋白質的殘留。最佳濃度為10mM。

1. 新增 5-15mM TCPE：

- 產量：160-178µg

恢復率：76 85％

- 完整性：約85%

- 雙股RNA：0.002-0.005µg/mg

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：0.20-0.52µg/mg

- 產品純度和品質好。

2. 使用 10mM TCPE：

- 產量：178µg

恢復率：85％

- 誠信度：85.4%

- 雙股RNA：0.002µg/毫克

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：0.20µg/mg

- 最佳的產品純度和品質。

洗滌比例

控制洗滌過程中層析緩衝液與注射用水的比例（10-25）：（75-90）可顯著提高產品完整性、回收率、封蓋效率，同時降低dsRNA和蛋白質殘留。最佳比例是15:85。

1. 比例 (10-25):(75-90):

- 產量：150-179µg

恢復率：71 85％

- 完整性：84-90％

- 雙股RNA：0.002-0.006µg/mg

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：約0.20µg/mg

- 產品純度和品質好。

2. 比例為15:85：

- 產量：179µg

恢復率：85％

- 完整性：90.0％

- 雙股RNA：0.002µg/毫克

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：0.20µg/mg

- 最佳的產品純度和品質。

組合純化方法

使用不同的純化方法可以進一步降低產品中的 dsRNA 和蛋白質殘留量，提高整體品質。純化方法的優選順序為：親和層析>超濾+親和層析>親和層析+纖維素層析>纖維素層析+超濾。僅親和層析法就能提供最佳結果。

1. 單獨親和層析法：

- 產量：179µg

恢復率：85％

- 完整性：90.0％

- 雙股RNA：0.002µg/毫克

封蓋效率：96.4％

- 蛋白質殘留量：0.20µg/mg

- 最高的產品純度和品質。

2. 超濾+親和層析：

- 產量：170µg（比單獨使用親和層析法少 9µg）

- 回收率：81%（比單獨使用親和層析法低 4%）

- 誠信度：88.5％

- 雙股RNA：0.0015µg/毫克

- 蛋白質殘留量：0.18µg/mg

- 與單獨使用親和層析相比，dsRNA 和蛋白質殘留量略有減少，但產量和回收率顯著降低。此方法較為複雜，使淨化時間加倍，成本增加。

3. 親和層析+纖維素層析/纖維素層析+超濾：

- dsRNA: 比單一方法低 0.005µg/mg

- 產量：少60-100µg

- 回收率：降低 30-40%

- 步驟增加會導致更高的勞動力和材料成本。

大規模生產

在大規模生產中，採用親和層析、親和層析與纖維素層析聯合使用、或超濾與親和層析聯合使用，自擴增mRNA的產量顯著提高到140-185μg，回收率可達67-88%。產品完整性為93-94%，dsRNA含量控制在0.0018-0.0020µg/mg，封蓋效率達96.1-96.4%，蛋白質殘留量維持在0.04-0.05µg/mg。這證明了大規模生產具有良好的可擴展性和效率。

參考：

[1] LiCl 沉澱法用於 RNA 純化，檢索日期：2024 年 1 月 8 日，資料來源：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html。

[2] 氯化鋰沉澱溶液產品資訊表，2024 年 1 月 8 日取自https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf。

[3] BeyoMag™ RNA Clean 磁珠產品，檢索日期：2024 年 1 月 8 日，來自 https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm。

[4] VAHTS RNA Clean Beads 產品，檢索日期：2024 年 1 月 8 日，來自 https://www.vazyme.com/product/215.html。

[5] 基於 Dynabeads™ 的固相體外轉錄和 RNA 純化，檢索日期：2024 年 1 月 8 日，資料來源： https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D。

[6] RNA Clean XP 效能與數據，2024 年 1 月 8 日取自 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance。

[7] 賽默飛世爾科技新聞，2024 年 1 月 8 日取自 https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/39287a37147e22e2d978f7dd9228df58。

[8] 自擴增mRNA原液的工業生產、分離純化方法及其應用[P].專利：CN118048418A。 2024.05.17。

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