突破性成就 Yeasen 和Molefuture生物技術

隨著生物技術的快速發展，mRNA治療作為一種新興的治療方法，因其可編程性強、響應速度快而備受關注。在mRNA疫苗、基因治療等領域，高效合成高品質mRNA是實現治療目標的關鍵步驟。在此過程中，T7 RNA聚合酶起著至關重要的作用，因為它能有效催化mRNA的體外合成。

T7 RNA 聚合酶的 dsRNA 副產物問題

雖然T7 RNA聚合酶在mRNA合成中扮演重要角色，但實際操作中常常會產生雙股RNA（dsRNA）作為副產物。 dsRNA的存在不僅會降低mRNA的產量和純度，還可能引發非特異性免疫反應，影響療效和安全性。因此減少dsRNA的產生已成為業界的迫切需求。 目前減少dsRNA的方法主要有優化反應條件和使用輔助酵素。這些方法雖然可以在一定程度上減少dsRNA的產量，但往往存在操作複雜、成本增加等問題。

為什麼我們要進行T7 RNA聚合酶工程？

直接修改T7 RNA聚合酶來減少dsRNA的產生是更根本的解決方案。酵素定向進化技術可以透過精確改變酵素的胺基酸序列或結構來改善其催化性能，提高產品的純度和產量。對於T7 RNA聚合酶，有針對性的改造不僅可以減少dsRNA的產生，而且可以提高mRNA合成的整體效率和品質。

作為mRNA體外合成原料供應商， Yeasen 生物技術，以及 其子公司Molefuture 生物技術, 有 利用ZymeEditor定向進化平台，開發出一種新型T7 RNA聚合酶。為了最大限度地減少體外轉錄過程中dsRNA等副產物的產生，進化團隊透過合理設計和定向篩選相結合的方式，對T7 RNA聚合酶進行了改造。

dsRNA 是如何產生的？

根據文獻報告，副產物dsRNA的產生主要來自兩個來源（圖1）：一是在轉錄早期，T7 RNA聚合酶由起始構象向延伸構象轉變過程中，轉錄三元複合物易發生解離[1]，導致大量長度為20nt左右的短RNA鏈（Abortive RNA）釋放到系統中。這些RNA鏈作為“引子”，與長RNA鏈互補配對，在T7 RNA聚合酶的RNA依賴性RNA聚合酶活性（RDRP活性）作用下延伸產生dsRNA [2,3]。第二個來源是由T7 RNA聚合酶所具有的末端核糖核苷酸轉移活性所引發的。當轉錄反應到達線性模板的末端時，T7 RNA聚合酶可能會隨機添加幾個核糖核苷酸，而不依賴模板。這些核糖核苷酸形成“隨機引子”，可以反向折疊並與目標 mRNA 區域互補配對，延伸產生 dsRNA。透過環化產生的 dsRNA 稱為環回 dsRNA [3,4]。因此，為了減少dsRNA副產物，T7 RNA聚合酶修飾的重點在於穩定早期轉錄三元複合物或削弱末端轉移活性和RNA依賴性RNA聚合酶（RDRP） T7 RNA聚合酶的活性。

圖1. 能量屏障及dsRNA形成原理示意圖 （未發表數據）

如何克服 能量屏障 T7 RNA 聚合酶 構象轉變？

研究團隊一方面透過結構和自由能分析發現，隨著T7 RNA聚合酶構象的變化，其能量也隨之改變。延伸構象的自由能明顯高於起始構象的自由能，顯示轉錄過程需要克服更高的能量障礙才能產生完整的 mRNA 鏈。過高的能壘不利於構形轉變的順利進行。因此，團隊利用 合理的 篩選方法鑑定了20多個熱點胺基酸，並建構了對應的飽和誘變文庫。

如何修改 T7 RNA 聚合酶的末端轉移和 RDRP 活性

另一方面，考慮到T7 RNA聚合酶的末端轉移活性和RDRP活性相關功能、位點和結構域的報告有限，且這兩種功能相似的活性可能與T7 RNA聚合酶的主要反應——轉錄活性（即DNA依賴性RNA聚合活性，DDRP）共享關鍵位點，因此很難找到定點修飾的熱點氨基酸。因此，團隊同時建構了多個基於易錯PCR的隨機突變文庫，結合ZymeEditor平台的高通量進化能力，使得每個文庫的多樣性超過10^6。

基於探測的理想發現 T7 RNA聚合酶

為了平衡T7 RNA聚合酶的產生，監測體外轉錄反應中dsRNA的含量，團隊參考優化的轉錄模板，精心設計了多個螢光 針對目標 mRNA 產物不同區域的探針。這些探針將反應產量、完整性和系統內的 dsRNA 含量等資訊與螢光訊號相關聯。體系螢光強度越強，突變體的表現越有利。理論上，此篩選方法可以根據不同探針的螢光強度對突變體進行排序，獲得產量高或Abortive RNA減少的T7 RNA聚合酶突變體，以及完整性提高或回環dsRNA減少的突變體。當用RNA取代反應模板時，也可以對RDRP活性降低的突變體進行負篩選，提高T7 RNA聚合酶的模板選擇性。此外，透過在液滴反應系統中添加修飾核苷酸、帽類似物、提高反應溫度等，可以進一步篩選出能夠耐受非天然底物、且熱穩定性提高的T7 RNA聚合酶突變體。

如何進行最佳篩檢 T7 RNA聚合酶？

根據圖書館的規模，團隊 開發了基於螢光活化液滴分選（FADS）的超高通量篩選流程和基於傳統微孔板方法（MTPS）的高通量篩選流程。透過多輪實驗，共篩選出超過10^7個突變體，得到多個dsRNA含量明顯降低的突變體。其中部分突變體表現出反應中Abortive RNA引起的dsRNA的減少，顯示這些聚合酶突變體的延伸構象更穩定。一些突變體表現出反應中環回 dsRNA 含量的降低，表明這些突變體中的末端轉移活性或 RDRP 活性減弱。

鑑於上述突變體的性能優勢源自於不同的機制，該團隊 已經建構了針對它們的DNA改組文庫。經過篩選後，團隊 最終獲得性能優異的突變體 具有極低的 dsRNA 生成，同時不影響產量和 mRNA 完整性（圖 2）。然而，Moderna 發現的突變體 G47A+884G 的產量受到影響^[5] （未發表）。

圖2. 酵素的進化過程及突變體性能表徵

（未發表）

dsRNA 生成分析 T7 RNA聚合酶 變體？

定量分析後，如圖 3 所示，在共轉錄加帽條件下，使用 9 kb 轉錄模板，野生型 T7 RNA 聚合酶在使用天然核苷酸時產生約 2.9 ng/μg dsRNA，而商業 T7酶 產生約0.18 ng/μg dsRNA。然而，每種 T7 RNA 聚合酶變體的 dsRNA 生成 建構的濃度小於0.10 ng/μg。特別是，一個 變體 僅0.015 ng/μg，比野生型低近200倍，比商業化低12倍 產品。經過反覆測試，在不同反應條件下一致觀察到突變體在還原dsRNA方面的性能優勢，表明這些突變體具有良好的系統相容性，為進一步透過反應緩衝液還原dsRNA的產生奠定了基礎 最佳化.此外，FADS篩選還獲得了多個產品完整性和熱穩定性提高的變體，可以滿足更廣泛的體外轉錄應用的要求

圖 3. 使用 T7 RNA 聚合酶變體評估 dsRNA 生成 Yeasen 雙股 RNA (dsRNA) ELISA 試劑盒和 J2 抗體點印跡分析。

目前，已有數家合作夥伴試用了T7 RNA聚合酶變體，並獲得了他們的高度評價。 新酵素的使用簡化了mRNA純化過程，提高了工作效率，並在多種應用場景中表現出色。

這些變體正在申請專利，我們歡迎討論技術合作和許可。

關於Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology 是 Yeasen 生物科技（上海）有限公司，專業提供以酵素進化技術為驅動的客製化化酶改造解決方案。利用資源 Yeasen 生物技術方面，Molefuture 擁有六大技術平台：ZymeEditor創新酶進化平台、多宿主高效表達平台、發酵製程開發平台、純化製程開發平台、超淨酶生產平台、酵素分析與品管平台。依托這六大技術平台，Molefuture可提供包括酵素定向進化、新型酵素開發、酵素製程開發、GMP等級放大生產等一整套客製化解決方案，滿足體外診斷、生物醫藥、合成生物學、醫學美容、醫藥中間體等領域的酵素應用需求。等

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以下是 Yeasen。有其他尺寸可供選擇。我們的產品經過高度優化，可以協同工作，幫助確保卓越的性能和可重複性。我們還可以提供客製化服務。如果您對未顯示的產品感興趣，請聯絡我們，我們將與您合作，滿足您的需求。

關於閱讀：

分享雙股RNA（dsRNA）ELISA試劑盒驗證報告，促進dsRNA檢測的標準化。

參考：

[1] Sousa R，Mukherjee S. T7 RNA 聚合酶[J]。核酸研究與分子生物學進展，2003：1-41。

[2] Steitz T A. T7 RNA聚合酶從轉錄起始到延伸的結構變化[J]。當前結構生物學觀點，2009，19（6）：683-690。

[3] Vallejo D、Nikoomanzar A、Paegel BM 等人。用於單細胞定向進化的螢光活化液滴分選[J]。 ACS合成生物學，2019,8(6):1430-1440。

[4] Gholamalipour Y、Karunanayake Mudiyanselage A、Martin C T. T7 RNA 聚合酶的 3′ 端添加是 RNA 自模板的、分佈的和多樣化的——RNA-Seq 分析[J]。核酸研究,2018,46(18):9253-9263。

[5] Dousis A、Ravichandran K、Hobert EM 等人。一種工程化的 T7 RNA 聚合酶，可產生不含免疫刺激副產物的 mRNA[J]。自然生物技術，2023,41(4):560-568。