共享雙鏈RNA（DSRNA）ELISA試劑盒的驗證報告，以促進DSRNA檢測的標準化。

您是否正在尋找一種可靠的方法來檢測 mRNA 體外轉錄過程中殘留的 dsRNA？雙股 RNA（dsRNA）ELISA 試劑盒是您最好的選擇。然而，由於有幾種商業試劑盒可用，需要注意的是，驗證數據可能並不總是公開的，導致 dsRNA 檢測不一致。這就是我們分享雙股 RNA (dsRNA) ELISA 試劑盒驗證報告的原因，該報告涵蓋特異性、精確度、準確度、靈敏度和耐用性。本報告可作為驗證特定實驗條件和監管藥典標準的 dsRNA 殘留檢測方法的參考指南。請詳細了解我們的驗證報告 促進dsRNA檢測的標準化。

雙股 RNA（dsRNA）ELISA 鉀它

背景：

雙股 RNA（dsRNA）ELISA 試劑盒是用於檢測 mRNA 體外轉錄過程中產生的殘留 dsRNA 的試劑盒。本試劑盒採用雙抗體夾心酵素連結免疫吸附試驗（ELISA）的實驗原理及生物素-鏈黴親和素擴增系統，可靈敏地檢測樣本中殘留的dsRNA。

匯總資料包含涵蓋特異性、精確度、準確性、敏感性和耐用性的驗證參數。該報告作為參考指南，敦促用戶根據其特定實驗條件驗證 dsRNA 殘留檢測方法並遵守監管藥典標準。

材料與方法：

成套工具： 雙股 RNA (dsRNA) ELISA 試劑盒：Cat#36717ES（Yeasen）。此試劑盒包含四種不同類型的 dsRNA 標準樣本。使用者可以選擇符合其特定流程的標準樣品類型來產生標準曲線，從而避免了準備和測試所有樣品的必要性。

方法：實驗所需的材料和程序步驟主要由 Yeasen 生物技術。該試劑盒經過大量的測試和評估，確保其性能符合ICH Q2(R1)和2020年版中國藥典第四部《9101分析方法驗證指導原則》的規定要求。

結果

  1. dsRNA 標準的線性

本報告針對所有四種不同類型的 dsRNA 標準制定了標準曲線，每種標準曲線的長度為 300bp。這些標準包括STD1，未修飾的dsRNA； STD2，偽 UTP 修飾的 dsRNA； STD3，N1-Me-Pseudo-UTP 修飾的 dsRNA；和STD4、5-OMe-UTP修飾的dsRNA。每種 dsRNA 標準都表現出優異的稀釋線性，R2 > 0.99，測量濃度的變異係數 (CV) 小於 10%，如表 1 至表 5 所示。

性病名稱

UTP 類型

稀釋線性 （R2＞0.99）

履歷

STD1

超五類雙絞線

0.0156-1皮克/微升

＜10％

STD2

尿苷三磷酸

0.0156-1皮克/微升

＜10％

STD3

N1-甲基-pUTP

0.0312-1皮克/微升

＜10％

STD4

5-甲基-UTP

0.0625-1皮克/微升

＜10％

表 1. 不同 dsRNA 標準的線性。

STD1 濃度n。 （皮克/微升）

測量平均值 （皮克/微升）

恢復

履歷

1

1.0001

100.0％

3.1％

0.5

0.4994

99.9％

2.4%

0.25

0.2516

100.7％

3.3%

0.125

0.1227

98.1％

0.5％

0.0625

0.0640

102.5％

3.2％

0.0312

0.0309

99.2％

1.3％

0.0156

0.0157

100.4％

3.2％

0

/

/

/

表 2.恢復和簡歷 稀釋的 STD1

STD2 濃度n。 （皮克/微升）

測量平均值 （皮克/微升）

恢復

履歷

1

1.0001

100.0％

0.7%

0.5

0.4994

99.9％

0.1％

0.25

0.2514

100.6％

0.9％

0.125

0.1232

98.6％

2.5％

0.0625

0.0635

101.6％

1.1％

0.0312

0.0312

99.9％

0.5％

0.0156

0.0155

99.6％

0.0%

0

/

/

/

表 3. 回收率和 CV 稀釋的 STD2

STD3 濃度 （皮克/微升）

測量平均值 （皮克/微升）

恢復

履歷

2

2.0031

100.2％

1.6%

1

0.9880

98.8％

2.4%

0.5

0.5188

103.8％

1.2％

0.25

0.2383

95.3％

2.2%

0.125

0.1242

99.4％

0.1％

0.0625

0.0629

100.7％

1.8％

0.0312

0.0361

115.7％

1.6％

0

/

/

/

表 4. 回收率和 CV 稀釋的 STD3

STD4 濃度 （皮克/微升）

測量平均值 （皮克/微升）

恢復

履歷

4

4.0096

100.2％

1.9％

2

1.9940

99.7％

0.7%

1

0.9977

99.8％

0.1％

0.5

0.5108

102.2%

0.1％

0.25

0.2454

98.2％

5.6%

0.125

0.1207

96.5％

2.8％

0.0625

0.0624

99.9％

0.3%

0

/

/

/

表 5. 回收率和 CV 稀釋的 STD4

  1. 特異性

  • 使用 dsRNA、ssRNA、dsDNA 和 ssDNA 進行特異性分析。
圖 1.此試劑盒僅辨識 dsRNA，不檢測 ssRNA、dsDNA 或 ssDNA。

  • 特異性不受 dsRNA 長度的影響。
圖2.此試劑盒的特異性對於不同長度（160 bp 和 500 bp）的 dsRNA 保持一致。

  1. 一個準確度

加入 0.5 pg/μL STD1 將已知 dsRNA 含量為 0.36 pg/μL 的 mRNA 樣本以三種不同體積比（1:1、1:20、1:250）純化。在所有情況下，尖峰迴收率都在 80-120% 範圍內。

加標回收率計算如下：加標 恢復 速率=（測量 專注 後 加標量×總量 體積 的 尖刺 樣品−測量 專注 的 這 樣本×總數 體積 的 這 樣品）/（理論 專注 的 這 峰值×體積 的 這 峰值）×100%

範例

STD1/樣品體積比

測量 dsRNA （皮克/微升）

長釘 恢復 速度

樣本 (TS)

/

0.36

/

TS+0.5pg/μL STD1

1：1

0.769

81％

TS+0.5pg/μL STD1

1：20

0.777

82％

TS+0.5pg/μL STD1

1：250

0.803

82％

表 6. 加標回收率 分析

  1. 精確

  • 批內精密度

對四個 dsRNA 標準樣本分別在三個濃度水平（高、中、低）上進行了實驗。在一次實驗中，每個濃度樣本經過八次重複測試。結果顯示變異係數（CV）低於15％ 表示具有良好的批內精度。

STD1

理論 濃度 （皮克/微升）

重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

1

8

1.0002

3.11％

0.125

8

0.1230

0.46%

0.0156

8

0.0164

3.18％

STD2

理論 濃度 （皮克/微升）

重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

1

8

1.0001

0.65%

0.125

8

0.1231

2.46%

0.0156

8

0.0162

0.02%

STD3

理論 濃度 （皮克/微升）

重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

2

8

2.0022

1.58％

0.25

8

0.2444

2.17％

0.0312

8

0.0328

1.64％

STD4

理論 濃度 （皮克/微升）

重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

8

8

8.0803

0.27%

1

8

0.9650

0.12%

0.125

8

0.1322

2.76％

表 7. 批內精密度分析

  • 批間精密度

使用來自 3 個 批次。在每個實驗中，選擇高、中、低濃度，對四個 dsRNA 標準樣本分別進行三次測試，重複八次。因此，每次採集 24 個數據點 濃度水平，然後進行變異係數（CV）分析。

STD1

理論 濃度 （皮克/微升）

獨立測試/重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

1

3/8

1.0007

2.38％

0.125

3/8

0.1186

3.20%

0.0156

3/8

0.0173

1.27％

STD2

理論 濃度 （皮克/微升）

獨立測試/重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

1

3/8

0.9987

0.09%

0.125

3/8

0.1269

1.06％

0.0156

3/8

0.0151

0.52%

STD3

理論 濃度 （皮克/微升）

獨立測試/重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

2

3/8

2.0012

2.37％

0.25

3/8

0.2415

0.14%

0.0312

3/8

0.0330

1.81％

STD4

理論 濃度 （皮克/微升）

獨立測試/重複

測量平均值 (pg/μL)

履歷

8

3/8

7.9735

1.89％

1

3/8

1.0225

0.13%

0.125

3/8

0.1227

5.63%

表 8. 批間精密度分析

  1. 敏感度

  • 詳細程度

檢測極限 成套工具 透過將兩倍標準差加到空白值的平均值來確定。透過測量24個空白樣品的OD值，計算其平均值和標準差，然後將這些值應用到擬合曲線上，得到對應的檢測極限 得到。

外徑

雙股RNA 標準

空白平均值

標準差 的空白

空白平均值+2SD

詳細程度

STD1

0.016

0.00048

0.01696

≤0.001pg/μL

STD2

0.016

0.00072

0.01744

≤0.001pg/μL

STD3

0.034

0.00119

0.03638

≤0.001pg/μL

STD4

0.115

0.00290

0.1208

≤0.01pg/μL

表 9. LOD 分析

  • 最低定量限

數量限制 成套工具 是透過將標準曲線的最低濃度點稀釋到更低的水平來建立的，確保最低濃度下的 CV < 20％，從而定義定量閾值。 LOQ如下。

雙股RNA 標準

最低定量限

重複

簡歷（％）

恢復 （%）

STD1

0.0156 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD2

0.0312 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD3

0.0156 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD4

0.125 皮克/微升

24

＜10%

80~120%
表 10.定量限分析

  1. 德耐用性

  • 抗IVT材料幹擾

這次測試 旨在評估添加到 信差核糖核酸 用該試劑盒對樣本的 dsRNA 進行檢測。

將特定濃度的 T7 RNA 聚合酶、RNAse 抑制劑、IPPA（無機焦磷酸酶）、DNase I、VCE（痘苗加帽酶）、2'-O-甲基轉移酶 (MT)、1×IVT 緩衝液和 1mM 檸檬酸鈉加入提供的 mRNA 樣本中，然後利用 STD3 用於標準曲線製備和樣品測試，可以評估該試劑盒檢測這些樣品中 dsRNA 含量的能力 樣品。結果表明，八種不同酵素和緩衝液的存在不會影響 dsRNA 的準確檢測。此外，觀察到的回收率在 80% 至 120% 範圍內。

IVT 材料

雙股RNA 測量值 (pg/μL)

恢復

沒有任何

0.6057

100％

T7 RNA聚合酶（15μg/mL）

0.5411

89.32％

小鼠 RNase 抑制劑 (27.5μg/mL)

0.5142

84.88％

無機焦磷酸酶（IPPA 10μg/mL）

0.7132

117.7％

脫氧核糖核酸酶 I (13.75μg/毫升)

0.6077

100.32%

痘苗加帽酶（10μg/mL）

0.6563

108.3％

2´-O-甲基轉移酶 (10μg/mL)

0.5776

95.4％

1×IVT緩衝器

0.5003

82.6％

1毫米 檸檬酸鈉

0.6251

103.2％

表 11. 添加 IVT 材料的稀釋 STD3 的回收率

  • 溫度d耐用性

這些工具包分別存放在 4°C 和 37°C 檢測7天後dsRNA標準品的濃度變化。結果表明，變異數均在20%以內。

雙股RNA 標準

雙股RNA 測量值（pg/μL）第 0 天

差異 4°C 下 7 天后

STD1

1

10％

STD2

1

5％

STD3

2

7%

STD4

4

11%

雙股RNA 標準

雙股RNA 測量值 (pg/μL)

差異 37°C 下放置 7 天后

STD1

1

18%

STD2

1

4%

STD3

2

5％

STD4

4

8%

表12. 溫度耐久性分析


      相關產品：

      產品名稱 庫存單位 規格
      雙股 RNA（dsRNA）ELISA 試劑盒 36717ES 48噸/96噸
      CleaScrip™ T7 RNA 聚合酶（低 ds RNA，250 U/μL） 10628ES 10/100 庫拉索
      T7 RNA聚合酶 GMP等級（250 U/μL) 10625ES 10/100 庫拉索

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      低 dsRNA T7 RNA 聚合酶突變體，協助 mRNA 疫苗和療法開發


      參考：

      1. ICH，2022：分析方法驗證 Q2，草案版本。
      2. 國家藥品監督管理局，2007年：《生物製品品質管制分析方法驗證評估通則》
      3. 國家藥典委員會（ChPC），2020年版：《中國藥典》第四部：生物樣品定量分析方法驗證指導原則

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