通過FADS和半理性設計的較低末端轉移酶和RDRP活性的T7 RNA聚合酶（低DSRNA）的開發。

近年來，基於mRNA的藥物受到了廣泛的關注並成為研究熱點。 T7 RNAP 因其簡單性和高產量催化 RNA 合成的能力而聞名，並且 體外保真度。然而，在轉錄過程中，T7 RNAP可以產生失敗的短RNA、過早終止的RNA、3’延伸的RNA等副產物，為dsRNA的形成創造了有利條件。因此減少dsRNA的產生已成為實際應用中的迫切需求。

最近，一項開創性的研究題為“FADS 和半合理設計改良的 T7 RNA 聚合酶降低了 dsRNA 的產生，降低了末端轉移酶和 RDRP 活性」線上發表於 Yeasen 和Molefuture團隊。研究人員透過定向進化和半理性設計相結合的方式，成功改造T7 RNAP，使其在轉錄過程中顯著減少dsRNA副產物的產生，將其降低至野生型酶的1.8%。

基於 FADS 的 T7 RNAP 篩選

對於T7 RNAP的篩選，選擇了FADS（螢光活化液滴分選技術）來滿足蛋白質進化的高通量需求。為了防止細胞過早碎裂，研究人員使用了具有雙水相的 PDMS 晶片，其中溶菌酶與晶片上的細胞混合，並在液滴中發揮其活性 圖 1。研究人員產生了幾個隨機突變庫，多樣性範圍從 10⁵ 到10⁶，經過篩選，鑑定出10個顯性變異，分別命名為Mut1至Mut10。  如圖所示 圖 2E 和 圖 2F，Mut1、Mut7、Mut9的dsRNA含量明顯低於野生型

圖 1. FADS 概覽

圖 2. 隨機文庫篩選與變異評估

T7 RNAP的半理性設計

研究者 進行了半理性設計探索，建立了十個單點飽和文庫，並採用傳統的基於微量滴定板的雙探針方法進行篩選（圖 3）。添加的5'端探針用於檢測RNA產量。

圖 3. 結構引導的半理性設計，用於減少 dsRNA

在篩選了1000多個突變體後，研究人員 確定了六個候選者：Mut11 (K180E)、Mut12 (S228F)、Mut13 (G238L)、Mut14 (A70Q)、Mut15 (A383H) 和 Mut16 (I743L)。所有六種突變體的總 RNA 產量與野生型沒有顯著差異，顯示整體轉錄效率相當。正如預期的那樣，Mut11 和 Mut14 的 dsRNA 含量與野生型相比明顯較低（圖 4）。

圖 4. 微量滴定板篩選與變異評估

DNA 改組產生的 Mut17 產生較少的 dsRNA

為了進一步優化T7 RNAP，篩選出4個dsRNA含量較低且能滿足生產需求的變異。研究人員隨後構建了一個 DNA 改組文庫，並用微量滴定板進行篩選，確定了一種與其親本 T7 RNAP 相比 dsRNA 產量較低的變體，名為 Mut17 (A70Q/F162S/K180E)。他們隨後分析了 Mut17 及其親本變異體（Mut14、Mut11 和 Mut7）的轉錄產物。如圖所示 圖 5，與野生型相比，四種變體在轉錄過程中均表現出 dsRNA 生成顯著減少。值得注意的是，Mut17 在篩選溶劑體系中顯示出明顯較低的 dsRNA 含量，僅 1.80%，低至 0.007 ng/μg。

圖5. Mut17及其親代突變的dsRNA含量

突變體的IVT產品的免疫原性明顯低於野生型。

下一個， 我們評估了 IVT 產品在小鼠 RA 的免疫原性W264.7 細胞。如圖 2A 和 2B 所示，類風濕性關節炎患者的 IFN-β mRNA 和蛋白質水準降低W264與野生型相比，轉染了突變體產生的 mRNA 的 .7 細胞表現出更高的免疫反應，表明野生型 T7 RNAP 合成的 mRNA 引發了最強的免疫反應，而來自突變體的 mRNA 則顯示出顯著降低的反應。 具體來說，經Mut11 RNA處理的細胞的IFN-β mRNA僅為野生型處理細胞的9.7％，其蛋白質為12.93 pg/mL。此外，EGFP 的表達在不同的 T7 RNAP 產生的 mRNA 中沒有表現出數量或質量的顯著差異 （圖 6C），滿足工業應用的要求。

圖 6. 哺乳動物細胞的 IFN-β 反應與 EGFP 表達

突變體的 RDRP 和末端轉移酶活性低得多我們比野生型更高。

為了研究突變對減少 dsRNA 的影響，研究人員 對所有這些突變進行了電腦研究。結果顯示變異體中的 RDRP 活性降低，因為它們顯示利用 RNA 作為模板的趨勢降低。同樣，這可能對 T7 RNAP 的末端轉移酶活性產生影響。 如圖所示 數位 7，不同濃度下，4種變體均表現出與野生型相比低於50％的螢光值。

隨後，採用 3' 端異質性分析來表徵 T7 RNAP 的末端轉移活性。當關注 n>0 的 RNA 比例時，這反映了末端轉​​移酶的活性，研究人員 發現這些RNA在野生型中佔82.94%，而突變體中的比例如下：Mut11（70.29%）、Mut7（67.88%）、Mut14（63.31%）和Mut17（55.62%） （數位 8）。重要的是，這些百分比與產品中 dsRNA 的豐度高度一致 （圖 5）。這些結果表明突變體的末端轉移酶活性顯著降低，這與 RDRP 活性的降低一起導致了 dsRNA 的減少。具體而言，末端轉移酶活性可能發揮更關鍵的作用，這可以透過在 Mut17 中觀察到的 n>0 RNA 累積最低來證明，同時 Mut17 也表現出最低的 dsRNA 產量 （圖 5 和圖 8）。

數位 7。相對 RDRP 活動

數位 8。 RNA 產物 3' 端的異質性

結論

這項研究提供了一種識別 dsRNA 含量降低的突變體的強有力方法，並成功分離了多個 RNA 依賴性 RNA 聚合酶和末端轉移酶活性降低的 dsRNA 突變體。它大大加強了對 mRNA 療法安全性和有效性的驗證，並強調了其對推進 mRNA 疫苗和基因治療應用的深遠影響。

同時，母公司 Yeasen 也推出了一款T7 RNAP產品，可顯著降低dsRNA 內容。多家合作夥伴已經測試了 Molefuture 開發的改良 T7 RNAP 突變體 產品得到了客戶的高度認可。我們的客戶認為，使用這種新型酵素簡化了 mRNA 的純化過程 大大降低了IVT的免疫原性 產品，在多個應用場景中展現出優異的表現，證明了其在生物製藥領域的廣泛潛在應用！

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