在高通量定序中，常規文庫建置需要PCR擴增。一方面是為了擴增微量DNA樣本，提高文庫產量。另一方面，它可以放大螢光訊號，使定序人員更容易捕獲和識別螢光訊號，以提高定序準確性。然而，PCR就像一把「雙面刃」。其在解決初始樣本量低、放大螢光訊號的同時也引入了擴增誤差和偏差，無法完美呈現基因組序列的「真實面貌」。此外，PCR聚合酶有一定的擴增偏向性。有些區域，特別是高GC或低GC、二級結構等區域，擴增效率低，難以覆蓋。也會引入大量錯誤的InDel，並帶來大量Duplication。 ，造成了DNA數據量的浪費，增加了定序成本。因此PCR-Free技術的引進不僅具有PCR的優點而且克服了PCR的缺點。不僅能帶來高靈敏度的高品質文庫，實現微量樣本的檢測，而且準確度高，減少後續變異研究的驗證工作量。那麼PCR-Free文庫到底是什麼，它有哪些優點呢？

1.什麼是PCR-Free文庫？
2.PCR-Free技術有哪些優點？
3. PCR-Free數據顯示
4. 常見問題
5. 產品資訊
6.關於閱讀

1.什麼是PCR-Free文庫？

新一代定序技術是現代分子生物學高通量定序研究中最常使用的技術。傳統的第一代定序已無法完全滿足研究人員的需求。模式生物的基因組重定序和非模式生物的基因組定序都需要更多的成本。更低、更高通量、更快速的定序技術，由此催生了第二代定序技術。第二代定序技術的核心原理是邊合成邊定序，即透過捕獲新合成的末端標記鹼基資訊來確定DNA序列。二代定序技術進行DNA定序的主要原理是先將DNA片段化，然後對片段化的DNA末端進行修復，然後在兩側添加特定的接頭，然後使用不同的方法產生數百萬個空間固定的PCR。對於克隆陣列，使用引子雜交和酶延伸反應對每個延伸反應所摻入的螢光標籤進行成像來獲得定序數據。

新一代定序技術進行DNA定序主要包括文庫製備和在機定序兩個過程。在文庫製備過程中，隨機中斷的基因組片段通常透過標準 PCR 進行擴增。但對於一些特殊的模板，存在複雜的二級結構或熱穩定性差等因素，影響模板PCR的擴增偏好性，因此並不是所有的基因組序列都能平等地反映在PCR擴增文庫中。特別是一些GC含量高或AT含量高的模板，有時很難用PCR的方法擴增建庫。 PCR-free文庫與常規PCR文庫在機上定序時並無區別，但在建庫過程中不進行PCR。從理論上講，無 PCR 文庫可以改善資料讀取的分佈並產生更均勻的基因組覆蓋。PCR-free文庫是文庫建構方法的一種補充。由於不經過PCR擴增而直接製備成機載文庫，可以提高一些高GC或高AT區域的覆蓋度，從而減少PCR引入的錯誤鹼基、數據偏差和序列重複。

常規NGS文庫建構的核心步驟為定序前基因組片段化、末端修復、接頭添加、PCR、訊號擴增。那麼，PCR-Free 文庫建置怎麼樣呢？顧名思義，這是一個不需要PCR的建庫過程。文庫建構的核心步驟是基因組片段化、末端修飾、接頭添加和文庫品質控制。但其實這在建庫過程中只能算是PCR-Free。真正的PCR-free應該是從建庫到定序的過程不需要進行文庫擴增（例如單分子定序技術）或是不存在PCR擴增誤差累積的定序技術（例如華大智造的DNBseq）。

圖1. 常規建庫及PCR-Free建庫流程圖

2.PCR-Free技術有哪些優點？

在常規建庫過程中，擴增酶可能會引入誤差。透過循環擴增，這些錯誤會被累積和放大，從而降低DNA序列複製的保真度。此外，DNA聚合酶也存在一定的擴增偏向性，特別是對於GC含量或二級結構差異較大的區域，導致擴增效率低、覆蓋均勻性差；在引入錯誤的InDels的同時，也會帶來大量的Duplication，造成DNA資料量的浪費，增加定序成本。 PCR-Free技術可以很好地避免常規建庫過程中PCR擴增所引入的上述問題。在建庫和定序過程中，如果有PCR擴增過程，則會對基因組覆蓋的均勻性造成較大的影響。對於DNA模板來說，有的具有複雜的二級結構，有的熱穩定性差異很大。這些因素都會影響PCR擴增的效率。因此在PCR擴增過程中，不能保證所有的基因組片段都能獲得相同的擴增效率，而是有明顯的擴增偏向，如基因組中高GC或低GC區域的覆蓋率較低。但PCR-Free定序整個過程沒有PCR環節。與PCR文庫建構相比，基因組高GC區域和AT/TA重複區域的覆蓋度有所提高。具體優點如下。

2.1 簡化建庫流程，節省時間

PCR-Free文庫製備省去了PCR擴增等步驟，簡化了文庫製備流程，節省了時間。

2.2 降低建庫成本

在傳統的建庫過程中，需要採用昂貴的高保真度酵素進行PCR擴增，以確保序列的真實性。同時，PCR-Free省去了PCR擴增步驟，降低了文庫製備成本。

2.3 減少擴增偏差

DNA擴增酶有一定的擴增偏差，特別是對於GC含量或二級結構差異較大的模板。因此PCR-Free可以有效避免聚合酶引起的擴增偏向性。

2.4 無 PCR 重複

PCR-Free可以減少重複讀取並提高唯一映射率和有效數據利用率。

2.5 減少誤差

PCR擴增更容易引入Insertion & Deletion的複製錯誤，導致Indel定序的錯誤率更高，而PCR-Free可以有效避免此類錯誤的產生和累積。

3. PCR-Free數據顯示

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圖2. PCR-Free文庫建構的脫機定序資料量

4. 常見問題

Q：哪些類型的樣本適合建立無PCR文庫？

A：對於二級結構複雜、GC含量高、PCR傾向性的樣本，可以選擇PCR-free文庫進行建構。

Q：PCR-free文庫的片段大小一般是多少？

A：PCR-free文庫本身對片段大小沒有特別要求。 PCR產物庫，是根據PCR產物的大小建構的資料庫。對於基因組文庫來說，建議在350bp左右，這樣文庫資料的品質相對較好。

5. 產品資訊

該產品 Yeasen 可以提供如表1所示。

表 1. 產品資訊

6.關於閱讀

DNA樣本NGS文庫製備解決方案

關於NGS相關技術，你了解多少？