常見問題

可能的原因

解決方案

陽性對照及待測樣本均未出現條帶。

PCR反應系統或反應條件不合適。

利用梯度PCR來探索PCR的最佳反應條件。

PCR試劑儲存不當會失去活性。

2×Mouse Direct PCR Mix應保存在-20°C下，使用過程中避免重複凍融。若頻繁使用，可短暫存放於4℃。

引子設計問題。

嘗試重新設計引子進行檢查。

陽性對照有目的條帶，而​​待測樣本無條帶或條帶較弱。

儲存不當或長時間儲存可能會導致試劑活性喪失。

使用新鮮試劑。

添加過量的組織裂解物。

增加反應體系，或減少裂解物的量。

樣本裂解混合物保存不當或保存時間過長，DNA基因組已降解。

裂解物混合物可以在 4°C 下保存 2-3 天。嘗試使用新鮮製備的裂解物混合物進行 PCR。

模板添加量不適合。

模板加入量優化在反應體系的1-10%範圍內。

PCR 循環次數不足。

增加PCR循環數，最好為35-40個循環。由於模板的複雜性，PCR 反應應比純化 DNA 模板多進行 5-10 個循環。

非特異性擴增

PCR 退火溫度太低、循環次數、引子濃度或模板濃度過高。

增加PCR退火溫度並減少PCR循環數、引子濃度或模板濃度。

PCR 引子不符。

重新設計 PCR 引子。

配製PCR反應體系時溫度過高或配製完成後時間過長。

PCR反應體系的製備在低溫下進行，製備完成後儘快進行PCR擴增反應。

陰性對照出現目標條帶

操作工具或試劑受到污染。

實驗中的所有試劑或設備都應高壓滅菌。處理時要小心、輕柔，以防止目標序列被吸入樣本槍或溢出離心管。

樣品之間的交叉污染。

每個採樣器僅用於一個樣品；或每取一個樣品，將取樣器邊緣浸入2％次氯酸鈉溶液中，反覆沖洗，然後用乾淨的紙巾擦乾殘留物。