描述
T7 High Yield RNA Synthesis Kit優化了轉錄反應系統。本試劑盒利用T7 RNA聚合酶，以T7啟動子序列的線性雙股DNA為模板，以NTPs為底物，控制啟動子下游的DNA序列，高效率合成單股RNA。在轉錄過程中，可以將修飾的核苷酸添加到底物中以製備生物素或染料標記的 RNA。
此試劑盒可合成長轉錄本及短轉錄本，每輸入1 μg DNA模板即可產生100-200 μg RNA。轉錄合成的RNA可用於各種下游應用，例如RNA結構和功能研究、RNase保護、探針雜交、RNAi、顯微注射、體外 翻譯。
圖 1：體外 RNA轉錄過程
特徵
- 每次反應可從 1 μg 對照模板產生最多 180 μg RNA
- 針對 IVT 製程優化的反應系統
- 減少 dsRNA 的產生
- 更高的 RNA 完整性和純度
應用
- 體外 RNA合成
成分
| 零件編號 | 姓名 | 10623ES50（50噸） | 10623ES60 (100噸) | 10623ES70 (500噸) |
| 10623-A | T7 RNA 聚合酶混合物 | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-B | 10×轉錄緩衝液 | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-C | ATP（100毫摩爾） | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-D | CTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-E | GTP (100毫摩爾/公升) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-F | 非屏蔽雙絞線 (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-G | 對照 DNA 模板（500ng/μL） | 10 微升 | 20 μL | 100 μL |
運輸和儲存
乾冰運輸。貯存於-15℃～-25℃，效期二年。
數位
圖 1. 使用 T7 RNA 合成試劑盒體外合成標準 RNA。
反應產物在PCR儀上37℃反應2h，再用磁珠(Cat#12602)純化。採用NanoDrop分光光度計分析產量結果如圖1所示。
圖2. T7試劑盒對不同長度RNA的轉錄展示，分別在電泳圖（圖2A）、毛細管電泳圖（圖2B）和色譜圖（圖2C）中
圖3.體外加帽RNA的合成。
反應產物在PCR儀上37℃反應2h，然後用磁珠(Cat#12602)進行純化。採用 NanoDrop 分光光度計測定產量結果，如圖 3A 所示。以毛細管電泳分析完整性結果如圖3B所示。
1. 轉錄產物產量低
模板的品質與產量密切相關。如果實驗組的產量明顯低於對照組，可能的原因是：
①實驗模板中含有抑製成分；
② 模板有問題。
建議：
①重新淨化模板；
②確定模板定量及其完整性；
③延長反應時間；
④ 增加範本輸入量；
⑤嘗試其他啟動子和RNA聚合酶。
2. 短轉錄本產量低
較短的轉錄起始片段會抑制反應。當轉錄產物少於100nt時，延長反應時間為4-8h或增加模板用量至2μg均可增加RNA產量。
3. RNA轉錄長度大於預期
若電泳結果顯示產物條帶大於預期的大小，可能原因為：
①質粒模板可能沒有完全線性化；
②正義鏈3’端具有突出的結構；
③RNA具有未完全變性的二級結構。
建議：
①檢查模板是否完全線性化，如有必要，進行額外的線性化；
②選擇適當的限制性內切酶，避免3’突出，或使用Klenow Fragment/T4 DNA聚合酶完成轉錄後再進行下一步；
③用變性凝膠檢測RNA產物。
4. RNA轉錄長度小於預期
若電泳結果顯示產物條帶小於預期的大小，可能原因為：
①模板含有與T7 RNA聚合酶類似的終止序列；
②模板中GC含量高。
建議：
①降低反應溫度（例如30℃）。有時降低溫度可以增加轉錄長度，但會降低產量。或嘗試不同的RNA聚合酶進行轉錄；
②如果模板GC含量較高，使用42℃ 轉錄，或添加 SSB 以增加產量和轉錄長度。
5. 轉錄產物電泳尾標
電泳過程中有拖尾現象。
可能的原因：
①實驗操作過程中受到RNase污染；
②DNA模板被RNase污染。
建議：
①使用RNase free的槍頭和EP管，戴上一次性乳膠手套和口罩，所有試劑均以RNase free的H2O配製。
②重新純化模板DNA。
[1] 董哲, 鄭娜, 胡晨, 等.Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) 透過調節宿主家蠶 (Bombyx mori) 中的 BmPEX16 基因表現來增加真菌的致病性。微生物學譜。 2021；9(2)：e0104821。 doi:10.1128/Spectrum.01048-21（影響因子：7.171）
[2] 王曉燕, 唐紹峰, 葉勝, 等.利用三鏈置換擴增級聯對循環 miR-195-5p 進行超靈敏定量。塔蘭塔。 2022；242：123300。 doi:10.1016/j.talanta.2022.123300（影響因子：6.057）
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