希夫^™ 快速細胞直接 以SYBR Green染料為基礎的RT-qPCR試劑盒適用於各類動物細胞（如細胞系壁細胞及懸浮細胞、原代培養細胞、各類幹細胞、iPS細胞等）的RNA萃取，無需萃取RNA，可直接用於qPCR表現分析，步驟短、操作簡便、錯誤率低。從模板準備到逆轉錄反應、基因表現分析等步驟僅需1.5小時即可完成。

試劑盒內包含逆轉錄和螢光檢測試劑，無需購買額外試劑即可進行基因表現分析。

規格

成分

貯存

將FCD裂解緩衝液和FCD洗滌緩衝液融化並儲存於4°C以防止污染。 FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix 需保存於-25~-15℃。

指示

1. 裂解產物的製備

1）1.試劑在室溫下熔化，使用前顛倒並輕輕混勻，輕微離心後使用，以避免產生泡沫*。

*未能混合試劑、使用振盪器混合以及未能在冰上配置試劑均會導致反應性能下降。

2)根據細胞類型**，將細胞轉移到離心管中，以 5000 rpm 離心 2 分鐘以收集細胞並吸出培養基孔。如果細胞在96孔板中培養，則可直接吸出培養基。

3)每孔加入150 μL FCD Washing Buffer，吹洗細胞，5000 rpm 離心2 min，棄去FCD Washing Buffer***。

4）每孔加入48 μL FCD Lysis Buffer Solution、2 μL DNase Ⅰ Solution，室溫吹打混勻後，靜置5分鐘，再加入2.孵育完畢後加入5 μL FCD Stop Solution****，再吹打混勻約5次，即得裂解產物*****。

** 細胞數量基本要求為1×10⁴ 每孔細胞數，本試劑盒可用於 1 × 10³ 1×10⁶ 細胞。若細胞數量較多，可酌情按比例增加FCD Lysis Buffer溶液及DNaseⅠ溶液的用量。

*** 離心條件因細胞而異，因此請以適合所用細胞的速度離心。

**** 將 2.5 μL FCD 終止液加入 50 μL 裂解物中，並視需要增加 FCD 終止液的量。

***** 如需長期儲存細胞裂解產物溶液，請放置在-20°C 下。

5）在室溫下融化4 x Hifair™ FCD RT Mix，輕微顛倒混勻，置於冰上，按下表配置反應體系：

*******建議使用量為2-5 μL，盡量不要超過45%。

1. 反轉錄

用移液管輕輕吹打並混勻上述配製的反應溶液，按下表步驟進行逆轉錄反應：

* 建議的逆轉錄溫度為55°C。對於高GC含量模板或複雜模板，逆轉錄溫度可提高至60℃。逆轉錄產物可直接用於下游RT-qPCR檢測。為了避免逆轉錄系統對qPCR反應的抑制，並得到適當的Ct值（10-35），可將產品稀釋10-1000倍後使用。如果短時間內不進行下游實驗， 可放置於-20℃保存。

1. 螢光定量PCR

1）反應 系統 配置

建議以以下比例來準備反應溶液（冰上準備）。

*請勿加入超過RT-qPCR體積的逆轉錄產物的1/10。模板濃度過高易造成非特異性擴增，稀釋5-50倍為宜。模板用量建議為4 μL，盡量不要超過6 μL。當反應性能較差時，引子濃度可在0.2-1.0μmol/L範圍內調整。

2）螢光定量PCR擴增步驟（兩步驟）

3）螢光定量PCR快速擴增流程（兩步驟）

* 退火/延伸溫度和最終延伸時間可以根據實驗要求進行適當調整。快速程序適用於大多數基因，對於個別複雜的二級結構基因可以嘗試標準程序。

筆記

1. 本產品僅供研究使用。
2. 為了您的安全，請穿著工作服和戴上一次性手套進行操作。

版本EN20230908

文件：

手冊

11172-Hieff™ 快速細胞直接。 EN20230908.pdf