希夫NGS^商標 OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 是新一代基於酵素片段化的文庫製備試劑盒 專門開發設計用於 伊路明納 &華大智造定序平台。與傳統的建庫方法相比，本產品採用了高品質的片段化酶，省去了繁瑣的超音波過程。它將碎片化和末端修復模組合而為一，簡化了操作。此外，連接模組的酵素和緩衝液是預先混合的，大大減少了文庫建構的時間和成本。這使得它更適合自動化圖書館建設。 此文庫製備試劑盒具有優異的文庫轉化率，適用於所有常見的動物、植物、微生物等樣本，也適用於FFPE樣本。 本產品在上一代建庫試劑盒的基礎上，在片段化、 末端修復、dA 尾部添加和適配器連接。高保真度酶顯著提高了擴增的均勻性和保真度。

規格

成分

[筆記]： 此套件組件相容 伊路明納 麥基爾 定序平台， 如果完整的適配器 被使用， 希夫NGS^商標 引子混合物（Yeasen 需要 Cat#12190 或 Cat#12191。

貯存

本品應儲存於-25~-15℃ 1 年。

筆記

1. 關於手術

1. 請穿戴工作服和一次性手套進行操作，為了您的安全。

2. 在室溫下解凍組件。 解凍後，渦旋充分混合，短暫旋轉管子並將它們放在冰上以供日後使用。

3. 配製各步驟反應溶液時，建議用移液管充分混合或輕輕搖晃。劇烈搖晃可能會導致文庫產量下降。

4. 強烈建議使用過濾移液管吸頭以避免交叉污染。處理不同樣品時務必更換移液管吸頭。

5.操作不當很可能造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。配備建庫專用移液管等設備，各區域進行常規清潔，以0.5%次氯酸鈉或10%漂白水擦拭表面

6.本產品僅供研究使用。

2. DNA碎片

1. 該試劑盒相容於 100 pg - 1000 ng 輸入 DNA。強烈建議使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高品質輸入 DNA。

2. 如果在輸入 DNA 中引入高濃度的鹽（如金屬螯合劑），後續實驗可能會受到影響。我們建議在 氫鍵₂哦 造成碎片化。

3. 請參考表格 6 標準DNA樣本的碎片時間。此試劑盒具有較低的碎片偏差，並為具有廣泛 GC 組成的 DNA 樣本提供均勻的 GC 覆蓋率。 請根據您的實驗要求調整碎裂時間。

4. 為了準確碎裂，請在冰上準備反應。

3. 接頭連接

1. Illumina或MGI長適配器（Barcoded Adapter）套件和短適配器套件可供客戶根據實驗需求進行選擇。

2. 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並註明需要嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備DNA退火溶液，每次只操作一種轉接器，以防止交叉污染。

3. 請在冰上或 4°C 下解凍適配器；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。

4. 接頭的品質和濃度將直接影響連接效率和文庫產量。接頭濃度過高有利於接頭二聚體的形成，而接頭濃度過少則會降低連接率和文庫產量。使用Adapter時，根據Input DNA量，以TE Buffer進行相應稀釋。 列出了在 Illumina 或 MGI 定序平台上使用該試劑盒對不同量輸入 DNA 的常規和 UMI 適配器的建議稀釋方法。

桌子 1 推薦的 Illumina 不同輸入的適配器數量 脫氧核糖核酸

桌子 2 推薦 麥格達 不同輸入的適配器數量 脫氧核糖核酸

4. 基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇

1. DNA 大小選擇可以在末端修復/dA 加尾之前、接頭連接之後或擴增之後進行。

2. 若輸入DNA量超過50ng，建議在接頭連接後立即進行大小選擇； 否則，請在擴增後進行尺寸選擇。

3. 連接增強劑含有高濃度的PEG，這可能會對準確的尺寸選擇造成重大影響。因此，如果要在接頭連接後立即進行尺寸選擇，則強烈建議在尺寸選擇之前添加珠子清理步驟。如果在末端修復/dA 加尾之前或之後進行尺寸選擇步驟，則可以直接進行 圖書館擴增。

4. 磁珠使用前應先在室溫下平衡，否則產量會下降，且會影響大小選擇效果。

5. 使用前應以渦旋或移液將磁珠混合均勻。

6. 轉移上清液時不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。

7. 80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。

8. 為了準確選擇尺寸，建議從超過 100 μL 的體積開始。若少於此量，建議以超純水補足至 100 μL。

9. 在洗脫產品之前，磁珠應該在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。

10. 如有需要，純化或大小選擇的 DNA 樣本洗脫於 0.1× TE 緩衝液可在 4°C 下保存 1-2 週，或在 -20°C 下保存一個月。

5. 文庫擴增

1. 是否進行文庫擴增取決於 DNA 輸入量、接頭類型、定序資料應用等。使用全長接頭時，若輸入DNA<200ng，建議擴增；否則，無需放大。

2. 應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入增加的偏差、錯誤、重複讀取和嵌合產物。桌子 3 列出了針對 1 μg 文庫產量的建議循環數。

桌子 3 建議的生成循環次數 1,000 ng 文庫產量

筆記

1.表格 3 顯示了使用200 bp左右的高品質Input DNA測試的loop參數數目。

2.如果在建庫過程中需要進行大小選擇，建議進行更高的文庫擴增循環次數；否則，建議降低循環次數。

3.若使用不完整接頭，至少需擴增2個循環才能形成完整接頭。

6. 圖書館品質分析

1. 建構的文庫質量一般透過測量濃度和粒徑分佈來分析。

2. 可以透過基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）測量文庫的濃度。

3. 不建議使用基於吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。

4. 建議使用 qPCR 方法進行文庫定量：基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen）無法區分不完整的 dsDNA 結構（沒有接頭或僅一端連接接頭的插入片段）和完整的文庫。 qPCR方法只會擴增和測量兩端都連接有接頭的完整文庫（可定序文庫），從而為載入提供更準確的測量。

5. 可以使用Agilent Bioanalyzer或其他基於毛細管電泳或微流體原理的設備來分析文庫的大小分佈。

7. 其他材料

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS^商標 DNA 選擇珠（Yeasen 目錄號 12601) 或 AMPure^® XP Beads（A63880）或其他同等產品。

2.適配器： Illumina 完整適配器： Yeasen 貓號#13519-13520； 384 雙 CDI 引子： Yeasen 貓號#12412~貓號#12413； 384 個獨特雙重索引 (UDI) 引子： Yeasen 貓號#12312~貓號#12315； UMI UDI 轉接器： Yeasen 貓號#13370~貓號#13371； MGI 完整適配器： Yeasen 貓號#13360-13362。 DNA 引子混合物：貓號#12190 或者 貓號#12191。

3. 文庫品質分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等產品；文庫定量試劑。

4. 其他材料：無水乙醇，無菌超純水，低保留移液管吸頭，PCR管，磁力架，熱循環儀等。

8. 工作流程

圖 1. 工作流程 一鍋 專業版 脫氧核糖核酸 文庫製備試劑盒

數位

不同片段化條件下所獲得的插入片段大小

使用500 ng標準gDNA作為模板，使用該試劑盒建立文庫。片段化條件為酵素切溫度分別為32℃、35℃、37℃，酶切時間分別為5、10、15、20、30分鐘。碎片產物以1.2x磁珠純化，並以21μL ddH洗脫₂O.使用Qubit測量濃度，回收的插入片段分佈如下圖所示。

圖 2. 32°C 下不同酵素消化時間的文庫概況

圖 3. 庫配置文件 35°C 下不同酵素消化時間

圖 4. 庫配置文件 37°C 下不同酵素消化時間