Hieff NGS® DNA&RNA 文庫共製備試劑盒 V2 是針對Illumina®&MGI®定序平台的DNA&RNA共文庫試劑盒，含有高效的cDNA合成試劑和酵素切試劑。與傳統圖書館相比 建造 方法，本產品可高效完成cDNA合成及DNA&RNA文庫構建 建造 該試劑盒含有用於 DNA 片段化的高品質酶，並將 DNA 片段化、末端修復和 dA 加尾結合為一個步驟，大大減少了文庫製備的時間和成本。 此文庫製備試劑盒具有優異的文庫轉化率，適用於所有常見的動物、植物、微生物等樣本，也適用於FFPE樣本。此升級試劑盒採用最新優化的連接酶，大大降低了接頭連接過程中的自連接速率。而且新型高保真聚合酶的引入，進一步提高了擴增的均一性和保真度。

試劑盒提供的所有組件均經過嚴格的品質控制和功能驗證，最大程度保證了建庫的穩定性和可重複性。

規格

成分

筆記： * 表示該試劑不包含在該試劑盒中，需要額外添加試劑。 是 相容雙平台 伊路明納^®麥基爾^®，但額外的引子混合物（CAT # 13334 MGI 引子混合物^® 和 Cat# 13335 Illumina 引子混合物^®） 是必須的。

工作流程：

貯存

本品應儲存於-25~-15℃ 1 年。

筆記

關於手術

1. 1.為了您的安全，請穿著工作服，戴上一次性手套操作。
2. 在室溫下解凍組件。解凍後，渦旋充分混合，短暫旋轉管子並將它們放在冰上以供日後使用。
3. 建議在帶有加熱蓋的熱循環儀中執行每個反應步驟。使用前應將熱循環儀預熱至設定溫度。
4. 請使用不含RNase的耗材污染。 經常。 ThermoFisher 的 RNAZap^商標 建議使用高效能核酸去除噴霧去除RNase污染。
5. 操作不當容易造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。附有建庫專用移液器等設備。
6. 6.本產品僅供研究使用。

接頭連接

1. Illumina或MGI長適配器（Barcoded Adapter）套件和短適配器套件可供客戶根據實驗需求進行選擇。
2. 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並註明需要嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備DNA退火溶液，每次只操作一種轉接器，以防止交叉污染。
3. 請在冰上或 4°C 下解凍適配器；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。
4. 接頭的濃度直接影響連接效率和文庫產量。試劑盒中添加的適配器體積固定為5μl。建議使用0.1×TE緩衝液稀釋接頭，稀釋後可在4°C保存48小時。桌子1 列出了針對不同量 RNA 輸入的建議接頭數量。

表 1-1 推薦的 Illumina^® 不同輸入的適配器數量 DNA和RNA

表 1-2 推薦的 MGI^® 不同輸入的適配器數量 DNA和RNA

*可依Total RNA樣本類型及投入量調整Adapter的使用。

文庫擴增

應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入增加的偏差、錯誤、重複讀取和嵌合產物。桌子 2 列出了針對 1 μg 文庫產量的建議循環數。

桌子 2 建議產生 DNA&RNA 文庫的循環次數 *

註：*文庫產量不僅與投入量、擴增循環數有關，也受樣本品質、破碎條件、分選條件等影響。在建庫過程中，依照實際情況選擇最適合的條件。

基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇

1. 1.文庫建置過程中有多個步驟需要DNA純化磁珠。我們推薦 Hieff NGS™ DNA 選擇珠（Yeasen 使用 AMPure® XP 磁珠 (Beckman Cat#A63880) 進行 DNA 純化和尺寸選擇。
2. 2.磁珠使用前需先在室溫下平衡，否則會降低產量並影響大小選擇效果。
3. 3.使用前應將磁珠以渦旋或移液管吹打混合均勻。
4. 4.轉移上清液時請勿吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。
5. 5.80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。
6. 6.洗脫產品前，磁珠應在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。
7. 7.如果需要，將純化或大小選擇的 DNA 樣本洗脫於1× TE 緩衝液可在 4°C 下保存 1-2 週，或在 -20°C 下保存一個月。

圖書館品質分析

1. 通常透過測量濃度和尺寸分佈來分析所建構的文庫品質。
2. 可以透過基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）測量文庫濃度。
3. 不建議使用基於吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。
4. 建議使用 qPCR 方法進行文庫定量：基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen）無法區分不完整的 dsDNA 結構（沒有接頭的插入片段或僅有一端連接接頭的插入片段）和完整的文庫。 qPCR方法只會擴增和測量兩端都連接有接頭的完整文庫（可定序文庫），從而為載入提供更準確的測量。
5. 可以使用 Agilent Bioanalyzer 或其他基於毛細管電泳或微流體原理的設備來分析文庫的大小分佈。

其他材料

1. 1.DNA純化磁珠：Hieff NGS™ DNA Selection Beads（Yeasen 目錄號 12601) 或 AMPure^®XP Beads（A63880）或其他同等產品。

2.適配器：Illumina 完整適配器（Yeasen Cat#13519-13520 或其他同等產品）或 MGI 完整轉接器（Yeasen Cat#13360-13362或其他同等產品）。

3. 文庫品質分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等產品；文庫定量試劑。
4. 其他材料：無水乙醇，無菌超純水，低保留移液管吸頭，PCR管，磁力架，熱循環儀等。

文件：

手冊

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA 文庫共製備試劑盒 V2.pdf