描述
產品描述
Hieff NGS™ Ultima 雙模式 RNA 文庫製備試劑盒是適用於 Illumina® 和 MGI® 定序平台的全 RNA 定序文庫建構試劑盒，包括 RNA 片段化試劑、逆轉錄試劑、常規和鏈特異性 ds-cDNA 合成試劑以及文庫擴增增訂試劑。可以建構定序文庫，然後使用mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒。雙股合成模組配備兩種緩衝液，以滿足常規文庫或鏈特異性文庫的需要。其中，鏈特異性雙股合成Buffer中dTTP被dUTP取代，因此dUTP可以添加到cDNA的第二鏈上。本試劑盒所使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含有尿嘧啶的DNA模板，進而達到鏈特異性。所提供的所有試劑均經過嚴格的品質控制和功能驗證，最大程度保證了建庫的穩定性和可重複性。
工作流程
產品組件
| 成分 | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime 緩衝液 | 250 微升 | 930 微升 | ||
| 12308-B | 第一鏈酵素混合物 | 48 微升 | 192 微升 | ||
| 12308-C | 鏈特異性試劑 | 150 微升 | 580 微升 | ||
| 12308-D | 第二鏈緩衝液 (dNTP) | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-E | 第二鏈緩衝液 (dUTP) | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-F | 第二股酵素預混液 | 120 微升 | 480 微升 | ||
| 12308-G | 連接增強劑 | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-H | 新型T4 DNA連接酶 | 120 微升 | 480 微升 | ||
| 12308-I | 2×超級 Canace® II 高保真混音 | 600 μL | 2×1200μL | ||
| 12308-K | 核酸酶遊離水 | 300 μL | 1000 μL | ||
注意：該試劑盒與 Illumina 和 MGI 平台相容，但額外的 Illumina 或 MGI 引子混合物（目錄號 13335 Illumina 引子混合物 和 Cat# 13334 MGI 引子混合物 ） 是 必需的。
運輸和儲存
盒 I 中的 Hieff NGS™ Ultima 雙模 mRNA 文庫製備試劑盒組件隨冰袋一起運輸，可在 2-8°C 下保存一年。
Box II 中的 Hieff NGS™ Ultima 雙模 mRNA 文庫製備試劑盒組件以乾冰運輸，可在 -20°C 下保存一年。
注意事項
1 操作
1.1 為了您的安全和健康，操作本產品時，請穿戴個人防護裝備（PPE），例如實驗室工作服和一次性手套。本產品僅供研究使用！
1.2 在室溫下解凍組件。上下顛倒幾次以充分混合，短暫旋轉並置於冰上備用。
1.3 建議在有加熱蓋的熱循環儀中進行每一步反應。使用前應將熱循環儀預熱至設定溫度。
1.4 必須提供不受RNase污染的物資並定期清潔實驗區域。
1.5 操作不當容易造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。附有建庫專用移液器等設備。
2 接頭連接
2.1 Illumina或MGI提供長Adapter（Barcoded Adapter）套件和短Adapter套件，客戶可以根據自己的實驗需求進行選擇。
2.2 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並備註需嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備DNA退火溶液，每次只操作一種轉接器，以防止交叉污染。
2.3 請將適配器放在冰上或4°C下解凍；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。
2.4 接頭的濃度直接影響連接效率和文庫產量。試劑盒中添加的適配器體積固定為5μl。建議使用0.1×TE緩衝液稀釋接頭，稀釋後可在4°C保存48小時。 表 1 列出了針對不同量 RNA 輸入的建議接頭數量。
表 1-1 不同起始 RNA 的 Illumina 接頭建議用量
| 輸入總 RNA | 伊路明納 適配器庫存濃度 |
| 10 納克 | 1 μM |
| 100 納克 | 1.5 μM |
| 500 納克 | 3 μM |
| ≥1微克 | 5 μM |
表 1-2 不同 RNA 輸入條件下 MGI® 接頭建議用量
| 輸入總 RNA | 麥格達 適配器庫存濃度 |
| 100-499 鄰 | 2 μM |
| 500-4000 納克 | 5 μM |
*可依Total RNA樣本類型及投入量調整Adapter的使用。
3 文庫擴增
3.1 試劑盒中的高保真DNA聚合酶在第一代DNA聚合酶的基礎上，大大提高了其擴增均勻度，無擴增偏向性。
3.2 若目標DNA上已連接Indexed Adapter（又稱長接頭或大Y型接頭），則可使用本試劑盒提供的引子混合物進行擴增；若使用「短接頭」或「小Y接頭」進行DNA連接，則需要使用索引引子進行擴增。
3.3 應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入偏差、錯誤、重複讀取、嵌合產物和擴增突變的累積。表 2 列出了 PCR 擴增的建議循環數。
表 2 建議的 RNA 文庫產生循環次數*
| 輸入總 RNA | 循環次數 | |
| 非擱淺 | 擱淺 | |
| 10 納克 | 15 | 15 |
| 100 納克 | 14 | 14 |
| 500 納克 | 12 | 十三 |
| 1微克 | 11 | 12 |
註：*文庫產量不僅與輸入量及擴增循環次數有關 也受到樣品質量、破碎條件和分選條件的影響。在建庫過程中，依照實際情況選擇最適合的條件。
4 基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇
4.1 文庫建構過程中有多個步驟需要DNA純化磁珠。我們推薦 Hieff NGS™ DNA 選擇珠（
4.2磁珠使用前應先在室溫下平衡，否則會降低產量並影響粒徑選擇效果。
4.3 使用前應將磁珠以渦旋或移液管吹打混合均勻。
4.4 轉移上清液時請勿吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。
4.5 80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。
4.6 洗脫產品前，磁珠應在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。
4.7 如有需要，用TE緩衝液洗脫後的純化或大小選擇好的DNA樣本可以在4°C下保存1-2週，或在-20°C下保存一個月。
5 文庫品質分析
5.1 通常可以透過長度分佈、濃度檢測來評估建構文庫的品質。
5.2 文庫濃度檢測：基於雙股DNA螢光染料的方法，例如Qubit®、PicoGreen®等；基於qPCR的絕對定量。
5.3 基於光譜檢測的方法，如NanoDrop®等，不適用於文庫濃度檢測。
5.4 文庫濃度檢測建議使用qPCR：透過Qubit®、PicoGreen®等基於雙股DNA螢光染料的方法，無法有效區分一端連接到接頭的產物、兩端未連接到接頭的產物以及其他不完整的雙股產物。 qPCR絕對定量是基於PCR擴增原理，只對樣本兩端接頭完整的文庫（即可定序的文庫）進行定量，排除單端或雙端未連接到接頭的非定序文庫的干擾。
5.5 文庫長度分佈檢測可採用Agilent Bioanalyzer 2100等以毛細管電泳或微流控原理為基礎的設備進行。
文件：
12308ES-Hieff NGS™ Ultima 雙模式 RNA 文庫製備試劑盒-Ver.EN20230327.pdf
引文及參考文獻：
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