希夫NGS^商標 EvoMax RNA 文庫製備試劑盒 (dUTP) 是一種 預混合， 放線菌素D 免費和 鏈特異性 全部的 RNA定序文庫 準備 套件相容於 Illumina 和 MGI 平台。本產品有兩種類型： 管子 或密封套件，以及 這個套件更多 方便的 是否透過自動液體處理裝置 或手動操作 。本試劑盒含有RNA片段化試劑、逆轉錄試劑、鏈特異性ds-cDNA合成試劑、文庫擴增試劑。 可與mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒併用， 進行mRNA或lncRNA研究。本產品透過優化逆轉錄模組，獲得不含放線菌素D的高鏈特異性文庫，更大程度上確保了實驗者的安全。所有試劑均經過嚴格的品質控制和功能驗證，以最大限度地提高文庫的穩定性和可重複性 準備。

規格

成分

註：* 符號表示該組件不包含在套件中。如果使用完整的接頭，則需要引子混合物，否則不需要‘噸。該試劑盒與 Illumina 和 MGI 平台相容，但需要額外的引子混合物（Cat # 13334 MGI 引子混合物^商標 如果使用完整的轉接器，則需要 Cat # 13335 Primer Mix for Illumina® 或 MGI 平台。

數位

板試劑組佈置。

圖1：封板文庫試劑盒試劑佈局

圖 2. 簡化組件 EvoMax RNA 文庫製備試劑盒。

貯存

本品應儲存於-25~-15℃ 1 年。

指示

1. 20 μL 系統建議添加量為 0.1-1 單位（U）， 並可依實際結果調整投入量。

2. 根據實驗的需要，dUTP的終濃度可以在0.2~0.6 mM之間調整，也可選擇性地添加0.2 mM的dTTP。

3. 25~37℃反應時間 可依實驗需要在5~10分鐘內調整。

筆記

1. 手術

1） 請穿著工作服和一次性手套操作，為了您的安全。

2） 在室溫下解凍組件。上下顛倒幾次以充分混合，短暫旋轉並置於冰上備用。

3） 建議在帶有加熱蓋的熱循環儀中進行每一步反應。使用前應將熱循環儀預熱至設定溫度。

4） 需要提供不含 RNase 污染的用品並定期清潔實驗區域。 ThermoFisher 的 RNAZap^商標 建議使用高效能核酸去除噴霧去除RNase污染。

5） 操作不當容易造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。 附有建庫專用移液器等設備。

6) 本試劑為一次性使用。嚴禁多次使用。

7)本產品僅供研究使用。

2. 適配器連接

1） Illumina或MGI長適配器（Barcoded Adapter）套件和短適配器套件可供客戶根據實驗需求進行選擇。

2） 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並註明需要嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備DNA退火溶液，每次只操作一種轉接器，以防止交叉污染。

3） 請在冰上或 4°C 下解凍適配器；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。

4） 接頭的濃度直接影響連接效率和文庫產量。 試劑盒中添加的適配器體積固定為5μl。建議使用0.1×TE緩衝液稀釋接頭，稀釋後可在4°C保存48小時。桌子 1 列出了針對不同量 RNA 輸入的建議接頭數量。

表 1-1 不同起始 RNA 的 Illumina 接頭建議用量

表 1-2 不同起始RNA對應的MGI接頭建議用量

* 可依不同種類的總RNA樣本及輸入量調整接頭使用量

3.文庫擴增

1）試劑盒中的高保真DNA聚合酶在第一代DNA聚合酶的基礎上，大大提高了其擴增均勻度，無擴增偏向性。

2） 應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入偏差、錯誤、重複讀取、嵌合產物和擴增突變的累積。 表 2 列出了 PCR 擴增的建議循環數。

3）表2建議的循環次數可滿足絕大多數建庫要求。如果您的樣本品質較差（例如降解嚴重的FFPE樣本），可以根據實際情況適當增加循環數。

表 2 輸入總 RNA 量和建議擴增循環數表 *

[註]：*文庫產量不僅與投入量、擴增循環數有關，也受樣本品質、破碎條件、分選條件等影響。在建庫過程中，依照實際情況選擇最適合的條件。

4. 基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇

1）文庫建置過程中有多個步驟需要DNA純化磁珠。我們推薦 Hieff NGS™ DNA 選擇珠（Yeasen 使用 AMPure® XP 磁珠 (Beckman Cat#A63880) 進行 DNA 純化和尺寸選擇。

2）磁珠使用前應平衡至室溫，否則 產量會下降，且會影響篩選效果。

3） 使用前應以渦旋或移液將磁珠混合均勻。

4） 轉移上清液時不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。

5） 80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。

6） 在洗脫產品之前，磁珠應該在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。

7） 如果需要，在 TE 緩衝液中洗脫的純化或大小選擇的 DNA 樣本可以在 4°C 下保存 1-2 週，或在 -20°C 下保存一個月。

5.圖書館品質分析

通常可以透過濃度檢測、長度分佈檢測來評估建構文庫的品質。

6. 其他材料

1）mRNA富集試劑盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2（Yeasen 貓號#12629）。

2）rRNA去除試劑盒：Hieff NGS® MaxUp 人類 rRNA 去除試劑盒（rRNA 和 ITS / ETS）（Yeasen Cat # 12257) 或其他 rRNA 去除試劑盒。

3）磁珠RNA純化：Hieff NGS® RNA Cleaner（Yeasen Cat # 12602) 或其他同等產品。

4) DNA 純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Cat # 12601) 或 AMPure® XP Beads (A63880) 或其他同等產品。

5)RNA品管：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他同等產物。

6) 適配器：供Illumina® 使用的完整適配器（Cat # 13519-13520 或其他等效產品）或MGI® 使用的完整適配器（Cat # 13360-13362 或其他等效產品）。

7. 文庫品質檢查

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000晶片/高靈敏度晶片或其他同等產品；文庫定量試劑。

8. 其他材料

無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

流程圖

圖1：RNA文庫建構流程

不同品質 FFPE 樣本的 RNA 文庫製備

對於嚴重降解的 FFPE RNA（DV 200 <50%）和低輸入樣本，我們建議在接頭連接後採用雙重純化方案，以減少文庫損失。

不同質量 FFPE 樣本的峰圖