希夫NGS^商標 DNA Library Prep Kit 是專為 伊路明納® 麥基爾® 定序平台。本產品在上一代文庫建構試劑盒的基礎上，在末端修復、dA加尾、接頭連接等方面均較先前版本有更高的效率。高保真度酶顯著提高了擴增的均勻性和保真度。此試劑盒相容於大多數 DNA 樣本類型，包括來自動物/植物/微生物的標準基因組 DNA、FFPE 樣本、cfDNA 和 ChIP DNA。

規格

成分

貯存

本品應儲存於-25~-15℃ 1 年。

筆記

1. 關於手術

1。為了您的安全，請穿著工作服和戴上一次性手套進行操作。

2. 在室溫下解凍組件。 解凍後，透過渦旋充分混合，短暫旋轉管子並將它們放在冰上以備後用。

3. 配製各步驟反應溶液時，建議用移液管充分混合或輕輕搖晃。劇烈搖晃可能會導致文庫產量下降。

4. 強烈建議使用過濾移液管吸頭以避免交叉污染。處理不同樣品時務必更換移液管吸頭。

5.操作不當很可能造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。附有建庫專用移液器等設備。對每個區域進行常規清潔，用 0.5% 次氯酸鈉或 10% 漂白劑擦拭表面

6。本產品僅供研究使用。

2. DNA碎片

1. 此試劑盒適用於機械碎裂的 DNA 或酵素碎裂的 DNA。

2. 此試劑盒適用於100 pg - 1000 ng的輸入 DNA。強烈建議使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高品質輸入 DNA。表 1 列出了建議的輸入 DNA 量。

表 1 建議的 DNA 輸入量

筆記：當輸入DNA品質較差或需要進行DNA大小選擇時，應相應增加輸入DNA量。

3.「輸入 DNA」具體指準備進行末端修復/dA 加尾的 DNA 樣本。

4. 如果輸入的 DNA 樣本含有高濃度的鹽（如金屬螯合劑），建議在碎片化後進行珠子純化/尺寸選擇步驟。鹽可能會影響以下反應的效率，包括末端修復和 dA 尾添加。若採用機械碎裂法，請使用TE Buffer洗脫DNA樣本，請勿使用無菌超純水進行碎裂。如果使用酵素碎裂方法而沒有在進行文庫製備之前進行珠子清理或尺寸選擇，請確保使用的終止緩衝液不含有過量的金屬螯合劑。否則，請將碎片樣本進行清理或大小選擇，然後在 TE 緩衝液或無菌超純水（≤50 μL）中洗脫，然後再進行文庫製備。

3. 接頭連接

1。 Illumina或MGI長適配器（Barcoded Adapter）套件和短適配器套件可供客戶根據實驗需求進行選擇。

2。 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並註明需要嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備 DNA 退火溶液，並且每次只操作一種適配器，以防止交叉污染。

3。 請在冰上或 4°C 下解凍適配器；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。

4。 接頭的品質和濃度將直接影響連接效率和文庫產量。接頭濃度過高有利於接頭二聚體的形成，而接頭濃度過少則會降低連接率和文庫產量。使用Adapter時，根據Input DNA量以TE Buffer進行相應稀釋。 -5 列出了使用該試劑盒針對不同輸入 DNA 量的建議適配器稀釋方法。

桌子 2 推薦的 Illumina^商標 不同輸入的適配器數量 脫氧核糖核酸

桌子 3 推薦的 MGI^商標 不同輸入的適配器數量 脫氧核糖核酸

桌子 4 推薦的 Illumina^商標 烏米 不同輸入的適配器數量 脫氧核糖核酸

桌子 5 推薦的 MGI^商標 烏米 適配器米不同輸入的計數 脫氧核糖核酸

4. 基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇

1. DNA 大小選擇可以在末端修復/dA 加尾之前、接頭連接之後或擴增之後進行。

2. 如果輸入的 DNA 量超過 50 ng，建議在接頭連接後立即進行大小選擇； 否則，請在擴增後進行尺寸選擇。

3. 連接增強劑含有高濃度的PEG，這可能會對準確的尺寸選擇造成重大影響。因此，如果要在接頭連接後立即進行尺寸選擇，則強烈建議在尺寸選擇之前添加珠子清理步驟。如果在末端修復/dA 加尾之前或之後進行尺寸選擇步驟，則可以直接進行 圖書館擴增。

4. 磁珠使用前應先在室溫下平衡，否則產量會下降，且會影響大小選擇效果。

5. 使用前應以渦旋或移液將磁珠混合均勻。

6. 轉移上清液時不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。

7. 80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。

8. 為了準確選擇尺寸，建議從超過 100 μL 的體積開始。若少於此量，建議以超純水補足至 100 μL。

9. 在洗脫產品之前，磁珠應該在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。

10. 如有需要，純化或大小選擇的 DNA 樣本洗脫於 0.1× TE 緩衝液可在 4°C 下保存 1-2 週，或在 -20°C 下保存一個月。

5. 文庫擴增

1. 是否進行文庫擴增取決於 DNA 輸入量、接頭類型、定序資料應用等。使用全長接頭時，若輸入DNA<200ng，建議擴增；否則，無需放大。

2. 應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入增加的偏差、錯誤、重複讀取和嵌合產物。桌子 6 列出了針對 1 μg 文庫產量的建議循環數。

桌子 6 建議的生成循環次數 1,000 ng 文庫產量

筆記：

1.桌子 6 顯示了使用200 bp左右的高品質Input DNA測試的loop參數數目。

2.我若在建庫過程中需要進行大小選擇，建議進行較高的文庫擴增循環次數；否則，建議降低循環次數。

3.我如果使用不完整的接頭，則至少需要擴增2​​個循環才能形成完整的接頭。

6. 圖書館品質分析

1. 建構的文庫質量一般透過測量濃度和粒徑分佈來分析。

2. 圖書館‘可以透過基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）測量濃度。

3.不建議使用基於吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。

4. 建議使用 qPCR 方法進行文庫定量：基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen）無法區分不完整的 dsDNA 結構（沒有接頭或僅一端連接接頭的插入片段）和完整的文庫。 qPCR方法只會擴增和測量兩端都連接有接頭的完整文庫（可定序文庫），從而為載入提供更準確的測量。

5. 可以使用Agilent Bioanalyzer或其他基於毛細管電泳或微流體原理的設備來分析文庫的大小分佈。

7. 其他材料

1。 DNA純化磁珠：Hieff NGS^商標 DNA 選擇珠（Yeasen 目錄號 12601) 或 AMPure^® XP Beads（A63880）或其他同等產品。

2. 適配器：Illumina 完整適配器： Yeasen 貓號#13519-13520； 384 雙 CDI 引物： Yeasen 貓號#12412~貓號#12413； 384 個獨特雙重索引 (UDI) 引子： Yeasen 貓＃12312〜貓＃12315； UMI UDI 轉接器： Yeasen 貓號#13370~貓號#13371； MGI 完整適配器： Yeasen 貓號#13360-13362。 DNA引子混合物：貓＃12190 或者 貓＃12191。

3. 文庫品質分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等產品；文庫定量試劑。

4. 其他材料：無水乙醇，無菌超純水，低保留移液管吸頭，PCR管，磁力架，熱循環儀等。

指示

步驟1. 末端修復/dA-Taling

1. 解凍 表中提到的試劑 7 。倒置以徹底混合試劑並將其放在冰上以供稍後使用。

2. 依表格組裝試劑 7 在冰上。

桌子 7 末端修復/dA-Tailing反應體系

3. 透過移液或搖晃輕輕混合，短暫離心以使溶液沉澱。

4. 將管子放入熱循環儀中並依照表 8 設定程序。

桌子 8 末端修復/dA 尾巴添加 反應程式

第 2 步。 接頭連接

1. 依照表2將適配器稀釋至適當濃度-5。

2. 解凍 表中提到的試劑 9 。倒置以徹底混合試劑並將其放在冰上以供稍後使用。

3. 依表格組裝試劑 9 在冰上。

桌子 9 接頭連接 關於動作系統

筆記：* 結紮增強劑具有黏稠度。請透過倒置或旋渦充分混合， 使用前短暫離心。

**原始濃度 伊路明納^商標 YEASE的接頭為15μM。請根據投入量稀釋適配器 和 使適配器的體積固定為 5 μL。

**原始濃度 麥格達^商標 YEASE 適配器為 10 μM。請根據投入量稀釋適配器 和 使適配器的體積固定為 5 μL。

4. 輕輕上下吹打以充分混合，然後短暫旋轉以收集管壁上的所有液體。

5. 依表所示，將樣品放入預熱的熱循環儀中孵育 10 並執行適配器連接反應。

桌子 10 接頭連接反應程序

步驟3. 接頭連接後的清理或尺寸選擇

此步驟用於純化或篩選步驟中的產品 2 帶有磁珠。純化可以去除殘留的接頭、接頭二聚體或其他不可用的產品。

克萊爾n 接頭連接的 DNA

1. 準備：進行 Hieff NGS^商標 將 DNA 選擇珠從冰箱中取出，並在室溫下平衡至少 30 分鐘。新鮮配製80％乙醇。

2. 透過倒置或渦旋徹底混合珠子。

3. 添加 88 微升 希夫NGS^商標 DNA 選擇珠 (0.8×，珠子：DNA = 0。8：1)加入到含有接頭連接產物的管中，搖勻，室溫孵育5分鐘。

4. 短暫離心以使溶液沉降，然後將離心管放在磁力架上。待磁珠完全吸附後（約5分鐘），小心除去液體。

5. 將管子放在磁力架上， 直接在管中加入200 μL新鮮配製的80%乙醇。在室溫下孵育 30 秒，然後小心地去除液體。

6. 重複 重複第 5 步。

7. 將管子放在磁力架上，打開蓋子，乾燥珠子直到珠子剛剛破裂（不超過 5 分鐘）。

8. 將管子從磁力架上取下進行洗脫 並洗脫 DNA

1). 如果產品不需要選擇尺寸，則添加21 μL ddH₂直接哦。以渦旋或上下移液 10 次來徹底混合。室溫下孵育 5 分鐘。短暫旋轉管子並將其放在磁力架上。當溶液變清澈時（約 5 分鐘），小心地將 20 μL 上清液轉移到新的 PCR 管中，不要接觸到磁珠。

2). 如果產品需要選擇尺寸，請添加102 μL ddH₂直接哦。以渦旋或上下移液 10 次來徹底混合。室溫下孵育 5 分鐘。短暫旋轉管子並將其放在磁力架上。當溶液變清澈時（約 5 分鐘），小心地將 100 μL 上清液轉移到新的 PCR 管中，不要接觸到磁珠。

筆記：若純化產物需要保存，可以用TE Buffer進行洗脫。

接頭連接 DNA 的大小選擇

1.準備：進行 Hieff NGS^商標 將 DNA 選擇珠從冰箱中取出，並在室溫下平衡至少 30 分鐘。新鮮配製80％乙醇。

2. 透過倒置或渦旋徹底混合珠子。

3. 根據目標大小，依照表 1 的步驟將第一輪磁珠加入 100 μL 純化的 DNA 模板中 11。以渦旋或移液 10 次徹底混合。

桌子 11 建議的珠子：基於珠子尺寸選擇的 DNA 比例

筆記：表中「×」表示DNA樣本體積。例如，文庫插入片段長度為250bp，樣本DNA體積為100μL，第一輪分選所用磁珠體積為0.7×100μL=70μL；第二輪分選所用磁珠體積為0.20×100μL=20μL。表中建議的珠子體積適用於接頭連接的 DNA。如果在連接前進行尺寸選擇程序，請參閱 Hieff NGS 的製造協議^商標 DNA 選擇珠（Cat#12601）。

4. 我室溫下孵育 5 分鐘。

5. 短暫旋轉管子並將其放置在磁力架上。當溶液變清澈時（約 5 分鐘），將上清液轉移到新的 PCR 管中。

6. 將第二輪選擇珠加入步驟 5 的樣本中 根據表 11。以渦旋或上下移液至少 10 次來徹底混合。

7. 我室溫下孵育 5 分鐘。

8. 短暫離心以使溶液沉降，然後將離心管放在磁力架上。待磁珠完全吸附後（約5分鐘），小心除去液體。

9. 將管子放在磁力架上， 直接在管中加入200 μL新鮮配製的80%乙醇。在室溫下孵育 30 秒，然後小心地去除液體。

10. 重複 步 9 再次。

11. 將管子放在磁力架上，打開蓋子，乾燥珠子直到珠子剛剛破裂（不超過 5 分鐘）。

12. 將管子從磁力架上取下進行洗脫， 和 直接加入21 μL ddH₂O. 以渦旋或上下移液徹底混合，並在室溫下孵育 5 分鐘。 （註：如需保存純化後的產品，請以TE Buffer洗脫。）短暫旋轉離心管，將其放置在磁力架上至液體變澄清（約5分鐘）。小心地將 20 μL 上清液轉移到新的 PCR 管中，不要接觸珠子。

步驟4 文庫擴增

此步驟可以透過 PCR 擴增富集純化的或大小來選擇好的產物。

1。 解凍表中所列的試劑 12，顛倒混勻，置於冰上備用。

2。 在已滅菌的 PCR 管中組裝下列反應。

桌子 12 接頭連接 DNA PCR 反應 系統

[筆記]： * 如果使用了完整的適配器， 希夫NGS^商標 底漆混合物 （Yeasen 貓＃12190 或 Cat#12191） 需要；如果使用不完整的適配器（Cat#12412~Cat#12413、Cat#12312〜貓＃12315，Cat#13370~Cat#13371），請參考試劑盒說明書，使用試劑盒提供的Index Primer進行擴增。

3. 透過移液或搖晃輕輕混合，並短暫離心以使溶液沉澱。

4. 將管子放入熱循環儀並根據表格設定程序 十三 開始放大。

桌子 十三 PCR擴增反應程序

步驟5 擴增後清理/片段選擇

清潔 向上步驟參考 步 3。希夫NGS^商標 使用DNA選擇珠（0.9×，珠子：DNA = 0.9：1）純化PCR產物。如果需要選擇尺寸，請參考 步 3。

第 6 步 最終文庫的品質控制

建構文庫的品質一般透過測量濃度和粒徑分佈來評估。詳情請參閱註釋 6。