描述
Hieff NGS™ OnePot Pro DNA 文庫製備試劑盒 V4 是專為 Illumina 搭配使用而設計的新一代酵素文庫製備試劑盒 以及華大智造高通量定序平台。與傳統的文庫製備方法相比，該試劑盒採用高品質的片段化酶，無需繁瑣的超音波處理過程。片段化和末端修復模組組合成一個步驟，大大減少了文庫製備的時間和成本。此試劑盒適用樣本類型廣泛，包括植物、動物基因組、微生物基因組等，樣本輸入範圍為1 ng至1 μg。酵素碎裂可確保不同物種間的片段大小均勻，且物種間差異最小。此外，該試劑盒可與 Illumina 配對 或 MGI 用於在 Illumina 或 MGI 高通量平台上定序的適配器和引子。
規格
| 貨號 | 12972ES08 / 12972ES24 / 12972ES96 |
| 尺寸 | 8 T / 24 96 年 電視 |
成分
| 零件編號 | 姓名 | 12972ES08 | 12972ES24 | 12972ES96 |
| 12972-一個 | 80 微升 | 240 微升 | 960 微升 | |
| 12972-B | 塗抹酵素™ 酵素 4.0 | 80 微升 | 240 微升 | 960 微升 |
| 12972-C | 連接增強劑 4.0 | 240 微升 | 720 微升 | 3×960 微升 |
| 12972-D | 迅速的 DNA連接酶 4.0 | 80 微升 | 240 微升 | 2×480 微升 |
| 12972-E | 2×Ultima HF 放大混合器 | 200 μL | 600 微升 | 3×800 μL |
貯存
本產品應在-25~-15℃下保存1 年。
筆記
1. 關於操作
1. 請穿戴工作服和一次性手套進行操作，為了您的安全。
2. 在室溫下解凍組件。 解凍後，透過渦旋充分混合，短暫旋轉管子並將它們放在冰上以備後用。
3. 配製各步驟反應溶液時，建議用移液管充分混合或輕輕搖晃。劇烈搖晃可能會導致文庫產量下降。
4. 強烈建議使用過濾移液管吸頭以避免交叉污染。處理不同樣品時務必更換移液管吸頭。
5.操作不當很可能造成氣溶膠污染，影響結果的準確性。建議強制物理隔離 PCR 反應混合區域和 PCR 產物純化檢測區域。附有建庫專用移液器等設備。對每個區域進行常規清潔，用 0.5% 次氯酸鈉或 10% 漂白劑擦拭表面
6.本產品僅供研究使用。
2. DNA碎片1. 該試劑盒相容於 100 pg - 1000 ng 輸入 DNA。強烈建議使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高品質輸入 DNA。
2. 如果在輸入 DNA 中引入高濃度的鹽（如金屬螯合劑），後續實驗可能會受到影響。我們建議在 氫鍵2哦 造成碎片化。
3. 請參考表格 6 標準DNA樣本的碎片時間。此試劑盒具有較低的碎片偏差，並為具有廣泛 GC 組成的 DNA 樣本提供均勻的 GC 覆蓋率。 請根據您的實驗要求調整碎裂時間。
4. 為了準確碎裂，請在冰上準備反應。
3. 適配器連接
1. Illumina或MGI長適配器（Barcoded Adapter）套件和短適配器套件可供客戶根據實驗需求進行選擇。
2. 建議選擇高品質的商業適配器。若選擇自製接頭，請委託有NGS引子合成經驗的公司，並註明需要嚴格控制污染。此外，建議在潔淨工作台中製備DNA退火溶液，每次只操作一種轉接器，以防止交叉污染。
3. 請在冰上或 4°C 下解凍適配器；室溫操作時，實驗室溫度不應超過25°C，以防止適配器變性。
4. 接頭的品質和濃度將直接影響連接效率和文庫產量。接頭濃度過高有利於接頭二聚體的形成，而接頭濃度過少則會降低連接率和文庫產量。使用Adapter時，根據Input DNA量以TE Buffer進行相應稀釋。 -3 列出了使用該試劑盒針對不同輸入 DNA 量的建議適配器稀釋方法。
表 1 針對不同輸入 DNA 的建議 Illumina 接頭用量
| 輸入DNA | 適配器稀釋（適配器體積：總體積） | 專注 |
| 1 鄰 | 三十-折疊（1： 三十） | 0.5 μM |
| 10 鄰 | 7.5-折疊（1： 7.5） | 2 μM |
| 100 納克 | 3-折疊（1： 3） | 5 μM |
| 1000 納克 | 1.5-折疊（1： 1.5） | 10 μM |
表 2 針對不同輸入DNA的建議MGI接頭用量
| 輸入DNA | 適配器稀釋（適配器體積：總體積） | 專注 |
| 1 鄰 | 20-折疊（1： 20） | 0.5 μM |
| 10 鄰 | 5-折疊（1： 5） | 2 μM |
| 100 納克 | 2-折疊（1： 2） | 5 μM |
| 1000 納克 | 未稀釋 | 10 μM |
4. 基於珠子的 DNA 清理和尺寸選擇
1. DNA 片段大小選擇步驟可以在接頭連接之後或文庫擴增之後進行。
2. 如果輸入的 DNA 量超過 50 ng，建議在接頭連接後立即進行大小選擇； 否則，請在擴增後進行尺寸選擇。
3. 連接增強劑含有高濃度的PEG，這可能會對準確的尺寸選擇造成重大影響。因此，如果要在接頭連接後立即進行尺寸選擇，則強烈建議在尺寸選擇之前添加珠子清理步驟。如果在末端修復/dA 加尾之前或之後進行尺寸選擇步驟，則可以直接進行 圖書館擴增。
4. 磁珠使用前應先在室溫下平衡，否則產量會下降，且會影響大小選擇效果。
5. 使用前應以渦旋或移液將磁珠混合均勻。
6. 轉移上清液時不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影響接下來的反應。
7. 80%乙醇應新鮮配製，否則影響回收效率。
8. 為了準確選擇尺寸，建議從超過 100 μL 的體積開始。若少於此量，建議以超純水補足至 100 μL。
9. 在洗脫產品之前，磁珠應該在室溫下乾燥。乾燥不夠容易造成乙醇殘留影響後續反應；過度乾燥會導致磁珠破裂，降低純化產率。通常情況下，在室溫下乾燥 3-5 分鐘就足以讓珠子完全乾燥。
10. 如有需要，純化或大小選擇的 DNA 樣本洗脫於 0.1× TE 緩衝液可在 4°C 下保存 1-2 週，或在 -20°C 下保存一個月。
5. 文庫擴增
1. 是否進行文庫擴增取決於 DNA 輸入量、接頭類型、定序資料應用等。使用全長接頭時，若輸入DNA<200ng，建議擴增；否則，無需放大。
2. 應嚴格控制擴增循環數。擴增不充分可能導致文庫產量低；過度擴增可能會引入增加的偏差、錯誤、重複讀取和嵌合產物。桌子 3 列出了針對 1 μg 文庫產量的建議循環數。
表 3 建議的生成循環次數 1,000 ng 文庫產量
| 輸入DNA | 產生 1 μg 文庫產量所需的循環次數 |
| 1000 納克 | 2 - 4 |
| 500 納克 | 2 - 4 |
| 250 納克 | 4 - 6 |
| 100 納克 | 5 - 7 |
| 50 納克 | 7 - 9 |
| 1 納克 | 12 - 14 |
筆記：
1.表格 3 顯示了使用200 bp左右的高品質Input DNA測試的loop參數數目。
2.我若在建庫過程中需要進行大小選擇，建議進行較高的文庫擴增循環次數；否則，建議降低循環次數。
3.我如果使用不完整的接頭，則至少需要擴增2個循環才能形成完整的接頭。
6. 圖書館品質分析
1. 建構的文庫質量一般透過測量濃度和粒徑分佈來分析。
2. 可以用基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）測量文庫濃度。
3. 不建議使用基於吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。
4. 建議使用 qPCR 方法進行文庫定量：基於螢光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen）無法區分不完整的 dsDNA 結構（沒有接頭或僅一端連接接頭的插入片段）和完整的文庫。 qPCR方法只會擴增和測量兩端都連接有接頭的完整文庫（可定序文庫），從而為載入提供更準確的測量。
5. 可以使用Agilent Bioanalyzer或其他基於毛細管電泳或微流體原理的設備來分析文庫的大小分佈。
7. 其他材料
1. DNA純化磁珠：Hieff NGS商標 DNA 選擇珠（
2. 適配器：Illumina 完整適配器：
3. 文庫品質分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等產品；文庫定量試劑。
4. 其他材料：無水乙醇，無菌超純水，低保留移液管吸頭，PCR管，磁力架，熱循環儀等。
8. 工作流程
圖 1.工作流程 一鍋 專業版 脫氧核糖核酸 文庫製備試劑盒
付款和安全
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