描述
希菲爾™ V 多重一步法 RT-qPCR 探針試劑盒 (聯合發展集團 加)是一款以RNA為模板的多重定量PCR試劑盒。實驗過程中，逆轉錄和定量PCR在同一管內進行，簡化了實驗操作，降低了污染風險。
本試劑盒採用耐熱Hifair高效合成第一鏈cDNA商標 V 逆轉錄酶和 UNICON 定量擴增商標 HotStart Taq DNA 聚合酶。此試劑盒主要含有優化的MP緩衝液、酵素混合物等。2+ 和 dNTP。此外，還添加了能有效抑制非特異性PCR擴增及提高多重qPCR反應擴增效率的因子，在確保擴增效率的同時，可進行多達多重的擴增反應。添加dUTP/UDG系統，有效防止氣溶膠污染的風險。
特徵
高靈敏度：精心優化的緩衝系統將低濃度模板的檢測靈敏度提高至250拷貝/毫升；
超強穩定性：產品經過18個月即時穩定性測試。
dUP/UDG 防污染系統：引進dUTP/UDG防污染系統，有效降低產品氣溶膠污染，降低假陽性，確保結果真實；
支援快速程序：相容快速程序，40min可出結果；
成分
| 零件編號 | 姓名 | 十三650ES50 （50 頁面） | 十三650ES60 (100 頁面） | 十三650ES80 (1,000 頁面） | 十三650ES92 （10,000 頁面） |
| 13650-A | 2×海菲爾商標 VMP 緩衝區 | 750 微升 | 1.5 毫升 | 15 毫升 | 150 毫升 |
| 13650-B | 海法商標 V 酵素混合物 | 60 μL | 120 微升 | 1.2 毫升 | 12 毫升 |
筆記： 1） 2×海菲爾商標 VMP 緩衝區 是 海法商標 V 多重一步法 RT-qPCR 探針緩衝液， 包括 dNTP、dUTP、Mg2+、穩定劑、增強劑等等。
2）Hifair商標 V 酵素混合物 主要包含 耐熱 Hifair商標 V 逆轉錄酶，UNICON商標 HotStart Taq DNA 聚合酶和 UDGase。
貯存
電視他 產品 應該 是 儲存 在 -25℃~-15℃ 為了 18個月。
指示
反應組成
| 成分 | 體積 （μL) | 最終濃度 |
| 2×海菲爾商標 VMP 緩衝區 | 15 | 1× |
| 海法商標 V 酵素混合物 | 1.2 | - |
| 底漆 / 探測 混合 （2.5 μM) | 3 | 0.25 μM |
| 模板RNA | 1-10 | - |
| RNase 自由 H2哦 | 至 30 | - |
筆記：使用前請務必搖勻，避免劇烈震動造成過多氣泡。
a) 底漆/探測 專注： 底漆 混合物包括多重引物， 根據情況，最佳引子濃度可能在0.1至1.0μM之間。探針混合物包括標記不同螢光基團的多重探針，根據情況最佳探針濃度可能在0.05和0.07之間。5 μM。
c) 模板稀釋：qPCR 敏感度較高，建議稀釋模板。對照Ct值在20~35之間較為合適。
d) 系統準備：卸下有濾芯的頭部。避免交叉污染和氣溶膠污染。
優化循環方案
|
| 反應階段 | 溫度 | 時間 | 循環 |
| 1 | 反轉錄 | 50 攝氏度一個 | 10 分鐘 | 1 |
| 2 | 初始變性 | 95°C | 5 分鐘 | 1 |
| 3 | 擴增反應 | 95°C |
| 45 個循環 |
| 60°Cb | 30 秒c |
筆記：a) R反向轉錄： 溫度可選擇42攝氏度 或 50攝氏度 10-15分鐘。
b) 擴增反應：依設計引子的Tm值調節溫度。
c) 螢光訊號擷取：請依照儀器說明書的要求設定實驗流程。
3. 應用 裝置
配備 Rox 的設備：ABI 5700、7000、7300、7700、7900HT Fast、StepOne™、StepOne Plus™
低 Rox 設備：ABI 7500、7500 Fast、ViiA™7、QuantStudio™ 3 和 5、QuantStudio™ 6、7、12k Flex
Stratagene MX3000P™、MX3005P™、MX4000P™
不含 Rox 的設備：
比奧拉d CFX96™、CFX384™、iCycler iQ™、iQ™5、MyiQ™、MiniOpticon™、Opticon®、Opticon® 2、Chromo4™
艾本德 Mastercycler® ep realplex、realplex 2 s； Qigen Corbett Rotor-Gene® Q、Rotor-Gene® 3000、Rotor-Gene® 6000
羅氏應用科學 LightCycler® 480、LightCycler® 2.0、Lightcycler® 96
熱 科學的 PikoReal 循環儀； 造父變星 SmartCycler®； 伊路明納 生態定量PCR
筆記
請穿戴必要的個人防護裝備，例如實驗服和手套，以確保您的健康和安全！
請使用不含RNase的耗材 為了 實驗。
敏感性測試
將-20℃保存18個月的13650（實驗組）及在保存期限內的13650同時進行針對ORF基因及N基因的偽病毒SARS-CoV-2梯度稀釋（500拷貝/ml、250拷貝/ml）檢測。每個濃度檢測8個重複孔，檢測率為100%。此外，擴增曲線峰形和Ct值沒有顯著差異。
| 很多 | FAM（陽性數） | VIC（陽性數） | ||
| 250份/毫升 | 500份/毫升 | 250份/毫升 | 500份/毫升 | |
| 實驗組 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| 對照組 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
即時穩定性測試
13650在-20°C下儲存18個月及在保存期限內的。兩組均同時檢測SARS-CoV-2假病毒ORF基因及N基因，濃度均為1000拷貝/ml，設20個重複孔。兩者的檢測率均為100%，擴增曲線形狀和Ct值沒有顯著差異。
圖 1. R編輯： 13650 在保存期限內；藍色的：13650 儲存於-20°C 下 18 個月。
經過多次凍融循環後性能穩定
將13650試劑與-20℃常溫保存的試劑一起，用乾冰進行30次和50次凍融循環，同時進行SARS-CoV-2假病毒ORF基因檢測，結果表明，經過50次凍融循環後，13650試劑的性能不受影響。
圖2.紅色：13650正常儲存於-20°C； 紫色的：13650 至 30 次凍融循環；綠色的：13650至50次凍融循環。
相容標準和快速協議
利用13650ES，在同一反應體系下以標準和快速兩種方案檢測SARS-CoV-2假病毒的ORF基因和N基因。結果顯示在4重體系下，兩種方案的擴增曲線峰形和Ct值無差異。
文件：
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