描述
細胞計數試劑盒-8（CCK-8）是基於WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑單鈉鹽）試劑的快速、高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8是MTT的升級試劑，可以被粒線體中的脫氫酶還原成水溶性極強的橙黃色甲臢。產生的甲臢的量 與活細胞的數量成正比。透過酶標儀檢測450nm處甲臢的OD值可間接指示活細胞的數量。本試劑盒廣泛應用於藥物篩選、細胞增殖及細胞毒性檢測、腫瘤藥敏測試、生物激素活性檢測等。
CCK-8方法的優點
1. CCK-8方法與其他細胞增殖/毒性檢測方法的比較。
| 檢測方法 | MTT 法 | XTT 方法 | WST-1 方法 | CCK 8 方法 |
|---|---|---|---|---|
| 甲臢產品的水溶性 | 低（需加有機溶劑溶解後再檢測） | 高的 | 高的 | 高的 |
| 產品特性 | 粉末 | 2瓶溶液 | 解決方案 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 混合成溶液並使用 | 該溶液在使用前立即製備。 | 開箱即用 | 開箱即用 |
| 檢測靈敏度 | 高的 | 非常高 | 非常高 | 高的 |
| 偵測 時間 | 長的 | 短的 | 短的 | 最短 |
| 檢測波長 | 560-600 奈米 | 420-480 奈米 | 420-480 奈米 | 430-490 奈米 |
| 細胞毒性 | 毒性大，細胞形態完全消失 | 低毒性，細胞形態不變 | 低的 毒性，細胞形態不變 | 低毒性，細胞形態不變 |
| 試劑穩定性 | 一般的 | 低的 | 一般的 | 高的 |
| 大宗樣品測試 | 可行的 | 合適的 | 合適的 | 合適的 |
2.酚紅和血清不干擾CCK-8檢測。
3.由於CCK-8試劑的細胞毒性很低，因此可以透過加入CCK-8試劑後在不同時間用酶標儀反覆讀數來確定最佳測定時間。
運輸和儲存
產品在-25~-15℃乾燥避光處可保存兩年。
預防措施
1. 在第一次實驗中，建議確定最佳接種細胞數和CCK-8試劑最佳培養時間。
2. 如果可能，請使用多通道移液管來減少重複孔之間的差異。實驗中應避免氣泡，因為氣泡會幹擾 OD 讀數。添加CCK-8試劑時，建議靠近培養板壁添加，而不是插入培養基中。
3.白血球可能需要更長的孵育時間。
4. 使用標準96孔板時，接種細胞數至少為1,000個細胞/孔（100 μL）。由於白血球的檢測靈敏度相對較低，因此建議至少接種 2,500 個細胞/孔（100 μL）。若使用24孔板或6孔板，則計算每孔對應的細胞數，並加入相應體積的CCK-8試劑（加入的CCK-8試劑體積為該板每孔培養基體積的10％）。
5.如果沒有450nm濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但450nm濾光片可以達到最高的檢測靈敏度。
6.酚紅不影響測定，可用減去空白組的吸光度來消除培養基中酚紅的吸光度。
7.為了您的安全與健康，操作實驗時請穿著實驗服，戴上一次性手套。
指示
一、製作標準曲線
1. 製備細胞懸浮液，測定細胞密度，然後將細胞接種於平板上。
2.依一定的比例（如1：2的比例）依序用培養基稀釋細胞，形成細胞濃度梯度，一般3-5個細胞濃度梯度，每個濃度3-6個重複孔。
3. 接種後，培養細胞2-4小時，使細胞貼壁。然後加入CCK-8試劑，孵育一定時間，測量OD值。以細胞數目為橫軸，OD值為縱軸，繪製標準曲線。根據此標準曲線，即可測定未知樣本中的細胞數量（使用此標準曲線的前提是實驗條件一致）。
二.細胞活力測定
1. 將細胞（100 μL/孔）放入96孔板中。將板放入培養箱中（37°C，5% CO2) 進行一段時間的預孵化。
2. 每孔加入10 μL CCK-8 試劑（注意不要讓氣泡進入孔中，否則會幹擾 OD 讀數），輕輕混勻。
3. 將培養板放入培養箱中，培養 1-4 小時。
4. 使用微孔板讀數儀測量 450 nm 處的吸光度。
5. 如果不立即測量 OD 值，則在每個孔中加入 10 μL 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，蓋上板並在室溫下避光保存。吸光度值在24小時內不會改變。
三細胞增殖和細胞毒性測定
1. 將細胞（100 μL/孔）放入96孔板中。將板放入培養箱中（37°C，5% CO2) 進行 24 小時的預孵育。
2. 將10 μL不同濃度的待測物質加入板中。
3.將培養板放入培養箱中，培養一定時間（如6、12、24或48小時）。
4. 每孔加入10 μL CCK-8 試劑（注意不要讓氣泡進入孔中，否則會幹擾 OD 讀數），輕輕混勻。
5. 將培養板放入培養箱中，培養 1-4 小時。
6. 使用微孔板讀數儀測量 450 nm 處的吸光度。
7. 如果不立即測量 OD 值，則在每個孔中加入 10 μL 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，蓋上板並在室溫下避光保存。吸光度值在24小時內不會改變。
筆記： 如果物質具有氧化性或還原性，則在加入CCK-8試劑之前，將舊培養基更換為新鮮培養基（移除舊培養基，用新鮮培養基洗滌細胞兩次，然後加入新鮮培養基），以消除該物質的作用。如果物質本身只有 一個 輕微 對吸光度值的影響，不需要更換培養基，用該物質的空白組吸光度值減去即可消除該物質的影響。
計算公式
細胞存活率=[(AC)/(BC)] x100%
抑制率=[(BA)/(BC)]x100%
A：實驗組吸光度（含細胞、CCK-8試劑、待測物質的培養基吸光度）
B：對照組吸光度（含細胞的培養基吸光度，CCK-8試劑）
C：空白組吸光度（含CCK-8試劑的培養基吸光度）
引用
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