Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒以EGFP標記的Annexin V作為探針，檢測早期細胞凋亡的發生。
檢測原理為：在正常活細胞中，磷脂醯絲胺酸（PS）位於細胞膜內側，但在早期凋亡細胞中，PS由細胞膜內側翻轉至細胞膜表面，暴露於細胞外環境。 Annexin-V 是一種 Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，分子量為 35 至 36 kDa，能夠高親和力地與 PS 結合。磷脂酰絲氨酸可以透過細胞外部暴露的磷脂酰絲氨酸與早期凋亡細胞的膜結合。
此外，還提供碘化丙啶 (PI) 來區分存活的早期細胞與壞死或晚期凋亡細胞。 PI是一種核酸染料，它無法穿過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以穿過晚期凋亡及壞死細胞的細胞膜，使細胞核變紅色。因此，當 Annexin V 與 PI 結合時，PI 被排除在活細胞之外（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡細胞（Annexin V⁺/PI^-）。晚期凋亡和壞死細胞對EGFP和PI呈雙陽性（Annexin V⁺/PI⁺）。
此試劑盒適用於流式細胞儀和螢光顯微鏡檢查。

產品組件

運輸和儲存

組件附有冰袋，可在-20°C 避光保存，避免反覆凍融，保存期為 1 年。
【注意事項】：若短期內需重複使用，可4℃避光保存，保存期間為半年。

注意事項

1) 由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議在染色後 1 小時內對樣本進行分析。
2）對於貼壁細胞，消化是關鍵的一步。請勿在消化液中使用 EDTA，因為 EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結合。
3)如要同時檢測細胞凋亡和細胞週期，應使用Annexin V-FITC來固定細胞，而不可使用Annexin V-EGFP，因為固定過程中EGFP會變性並失去激發螢光的能力。固定前將細胞與 Annexin V-FITC 一起孵育，然後用結合緩衝液洗掉未結合的 Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產生可與 Annexin V 結合併幹擾結果的細胞碎片。
4) 如果樣本是血液，請務必從血液中移除血小板。由於血小板中含有PS，PS能與Annexin V結合，幹擾檢測結果。可以使用含有EDTA的緩衝劑並在200g下離心以洗掉血小板。
5)開蓋前請先短暫離心試劑，並將蓋子內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體噴灑。
6) Annexin V-EGFP和PI為光敏物質，操作時請避開光照。
7)僅供研究使用！

指示

實驗設計
空白管：以未添加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution的陰性對照細胞進行電壓調節。
單染管：僅補充 Annexin V-EGFP 的陽性對照細胞用於調節補償。
檢測管：以 Annexin V-EGFP 和 PI 染色溶液處理細胞。透過調整空白管和單染管的參數來獲得實驗數據。
1.1 樣品染色
1)懸浮細胞： 在 4°C 下以 300 g 離心 5 分鐘來收集細胞。
貼壁細胞：用不含EDTA的胰蛋白酶消化後，4℃、300g離心5分鐘收穫細胞。
2)用預冷的PBS清洗細胞兩次，每次300g，4℃離心5分鐘。
3) 以1×Binding Buffer重懸細胞，調整濃度1~5×106/mL。
4) 取100 μL細胞懸浮液加入5 mL流式細胞儀管中，加入5 μl Annexin V-EGFP，混勻，室溫避光孵育5分鐘。
5) 加入10 μl PI溶液和400 μl PBS，立即染色。
【注意事項】：以流式細胞儀檢測細胞凋亡時，PI受時間影響較大，時間過長會導致PI染色增加，因此流式細胞儀檢測應在1小時內完成。
1.2 流式細胞儀分析
EGFP的最大激發波長為488nm，最大發射波長為507nm； PI-DNA複合物的最大激發波長為535nm，最大發射波長為615nm。以CellQuest等軟體進行分析，繪製雙色點圖，EGFP為橫座標，PI為縱座標。每個樣本收集 10,000 個事件。在典型的實驗中，細胞可分為三個亞群，活細胞僅具有非常低強度的背景螢光，早期凋亡細胞僅具有強烈的綠色螢光，晚期凋亡細胞具有綠色和紅色螢光雙染。