Annexin V-Alexa Fluor488/PI細胞凋亡檢測試劑盒的檢測原理為：在正常活細胞中，磷脂醯絲胺酸（PS）位於細胞膜內側，但在早期凋亡細胞中，PS由細胞膜內側翻轉至細胞膜表面，暴露於細胞外環境。 Annexin-V 是一種 Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，分子量為35～36KD，與PS有很高的親和力，透過暴露在細胞外的磷脂醯絲胺酸與早期凋亡細胞的細胞膜結合。
此外，還提供碘化丙啶 (PI) 來區分存活的早期細胞與壞死或晚期凋亡細胞。 PI是一種核酸染料，它無法穿過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以穿過晚期凋亡及壞死細胞的細胞膜，使細胞核變紅色。因此，當 Annexin V 與 PI 結合時，PI 被排除在活細胞之外（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡細胞（Annexin V⁺/PI^-）。相反，晚期凋亡和壞死細胞對 Alexa Fluor488 和 PI（Annexin V⁺/PI⁺）。

產品組件

運輸和儲存

這些組件隨附冰袋，可在 -20°C 下保存 1 年。

注意事項

1) 由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議在染色後 1 小時內對樣本進行分析。
2）對於貼壁細胞，消化是關鍵的一步。請勿在消化液中使用 EDTA，因為 EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結合。
3) 如果樣本是血液，請務必從血液中移除血小板。由於血小板中含有PS，PS能與Annexin V結合，幹擾檢測結果。可以使用含有EDTA的緩衝劑，並以200g離心將血小板洗掉。
4)開蓋前請先短暫離心試劑，並將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體噴灑。
5) Annexin V-Alexa Fluor488 和 PI 是光敏物質，操作時應避光。
6)僅供研究使用！

指示

1.1 樣品染色
1.a)懸浮細胞： 在 4°C 下以 300 g 離心 5 分鐘來收集細胞。
b) 黏附細胞：用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化後，在 4 °C 下以 300 g 離心 5 分鐘以收穫細胞。胰蛋白酶消化時間不宜過長，以防止假陽性。
2. 以4℃預冷的PBS清洗細胞兩次，每次300g，4℃離心5分鐘。
3. 加入250 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，調節濃度為1×106/mL。
4. 取100 μL細胞懸浮液加入5mL流式細胞儀管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488和10 μL PI，輕輕混勻。
5. 反應避光並在室溫下放置 15 分鐘。
6. 加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，1小時內進行流式細胞儀檢測。
[註]：為了避免在細胞清洗過程中細胞流失，可以使用小吸頭抽吸液體。
1.2 流式細胞儀分析
Alexa Fluor488的最大激發波長為488nm，最大發射波長為519nm； PI-DNA複合物的最大激發波長為535nm，最大發射波長為615nm。利用CellQuest等軟體進行分析，繪製以Alexa Fluor488為橫座標、PI為縱座標的雙色點圖。每個樣本收集 10,000 個事件。
1.3 螢光顯微鏡分析
1) 將一滴經 Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸浮液滴於玻片上，並用蓋玻片覆蓋細胞。
2)在雙色濾光片的螢光顯微鏡下觀察。 Annexin V-FITC螢光訊號為綠色，PI螢光訊號為紅色。