當細胞發生凋亡時，它們會活化內切酶，切割核小體之間的基因組 DNA。細胞凋亡時萃取DNA後，可發現180~200 bp的DNA梯狀條帶。
TUNEL（TdT介導的dUTP缺口末端標記）細胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640）可用於檢測組織細胞凋亡晚期過程中的核DNA碎片。其原理是在末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）的作用下，Alexa Fluor 640-12-DUTP 被摻入基因組 DNA 斷裂時暴露的 3'-羥基（3'-OH）末端。因此，可以透過螢光顯微鏡或流式細胞儀檢測。 Alexa Fluor 640 是一種穩定性高、亮度強的紅色螢光染料。
此試劑盒適用範圍廣泛，可用於檢測冰凍或石蠟切片中的細胞凋亡，以及培養的貼壁或懸浮細胞中的細胞凋亡。

產品組件

運輸和儲存

這些組件隨附冰袋，可在 -20°C 下保存 1 年。

注意事項

1.需自行配製PBS用於洗滌細胞，抗螢光猝滅液用於封片，4%多聚甲醛用於固定。白血球可能需要培養很長時間。
2.僅供研究使用！

指示

1. 樣品製備
1.1 石蠟包埋組織切片
1.1.1.將石蠟組織切片放入二甲苯中，室溫下浸泡5分鐘，重複1次，以徹底去除石蠟。
1.1.2.將切片浸泡在 100% 乙醇中，在室溫下 5 分鐘，重複一次。
1.1.3.室溫下，以梯度乙醇（90，80，70%）浸泡樣品，每次3分鐘。
1.1.4.用 PBS 輕輕沖洗切片，並用濾紙小心地吸乾玻璃片上樣本周圍多餘的液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣本周圍勾勒出樣本分佈的輪廓，方便後續的滲透性處理和平衡標記操作。實驗過程中不要讓樣品乾燥。將處理好的樣品放入濕盒內，保持樣品濕潤。
1.1.5.2 mg/mL蛋白酶K溶液以PBS以1:100的比例稀釋，達到終濃度為20 μg/mL。
1.1.6.每個樣品加入100 μL濃度為20 μg/mL的蛋白酶K溶液至完全覆蓋，室溫孵育20分鐘。
[註]：蛋白酶K有助於組織和細胞在後續步驟中對染色試劑具有滲透性。孵育時間過長會增加後續洗滌步驟中組織切片從載板上脫落的風險，而孵育時間過短可能造成通透性處理不充分，影響標記效率。為了獲得更好的結果，可能需要優化蛋白酶K的孵育時間。
1.1.7.用PBS溶液沖洗樣品2-3次，輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地吸乾載玻片上樣品周圍的液體。將處理好的樣品放入濕箱中，保持樣品濕潤。
1.2 組織冰凍切片
1.2.1.取出冷凍切片並恢復至室溫。將玻片浸入4％多聚甲醛溶液（溶於PBS）中，固定並在室溫下孵育30分鐘。
1.2.2.輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地吸乾玻璃載玻片上樣品周圍多餘的液體。
1.2.3.將載玻片浸入PBS溶液中，在室溫下孵育15分鐘，然後再用PBS再清洗2次。
1.2.4.輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地擦拭玻璃載玻片，以去除樣品周圍多餘的液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣本周圍勾勒出樣本分佈的輪廓，方便後續的滲透性處理和平衡標記操作。實驗過程中，不要讓樣品乾燥，將處理好的樣品放入潤濕箱中，保持樣品濕潤。
1.2.5.將2 mg/mL蛋白酶K溶液以PBS以1:100的比例稀釋，達到終濃度20 μg/mL。
1.2.6.每個樣品加入100 μL濃度為20 μg/mL的蛋白酶K溶液，至完全覆蓋樣品，室溫孵育10分鐘。
[註]：蛋白酶K有助於組織和細胞在後續步驟中對染色試劑的滲透性。孵育時間過長會增加後續洗滌步驟中組織切片從載板上脫落的風險，而孵育時間過短可能造成通透性處理不充分，影響標記效率。如果沒有獲得更好的結果，可能需要優化蛋白酶K的孵育時間。
1.2.7.在含有 PBS 溶液的敞口燒杯中沖洗樣本 2-3 次。
【注意事項】：為避免清洗步驟中樣本剝離造成損失，建議不要清洗瓶子，而是將玻片浸泡在PBS溶液中2-3次進行清洗。
1.2.8.輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地吸乾載玻片上樣本周圍的液體。將處理好的樣品放入濕盒內，以保存樣品的水分。
1.3 細胞爬行片的製備
在 Lab-Tek 腔室玻片上培養黏附細胞。經過細胞凋亡誘導處理後，再用 PBS 清洗玻片兩次。
1.4 細胞抹片的製備（以聚賴氨酸包被的玻片為例）
1.4.1.將細胞以約2×107個細胞/mL的濃度重懸於PBS中，吸取50~100μL細胞懸浮液於聚賴氨酸包被的玻片上，用乾淨的玻片將細胞懸浮液輕輕鋪開。
1.4.2.固定細胞，將玻片浸入含有新鮮配製的4%多聚甲醛的PBS染色槽中，4℃放置25分鐘。
1.4.3.將玻片洗淨、浸入 PBS 並在室溫下放置 5 分鐘。再次用 PBS 清洗。
1.4.4.輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地擦拭玻璃載玻片，以去除樣品周圍多餘的液體。此時，可用石蠟筆或疏水筆在樣本周圍勾勒出樣本的分佈情況，以方便下游的通透性處理和平衡標記操作。實驗過程中，不要讓樣品乾燥，將處理好的樣品放入潤濕箱中，保持樣品濕潤。
1.4.5.將2 mg/mL蛋白酶K溶液以PBS以1:100的比例稀釋，達到終濃度20 μg/mL。
1.4.6.每個樣品加入100 μL濃度為20 μg/mL的蛋白酶K溶液，使其完全覆蓋，室溫孵育5 min（也可將其浸入PBS配製的0.2%Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min，進行通透性處理）。
[註]：蛋白酶K有助於組織和細胞在後續步驟中對染色試劑的滲透性。孵育時間過長會增加後續洗滌步驟中組織切片從載板上脫落的風險，而孵育時間過短可能造成通透性處理不充分，影響標記效率。如果沒有獲得更好的結果，可能需要優化蛋白酶K的孵育時間。
1.4.7.用 PBS 沖洗樣本 2-3 次，輕輕去除多餘的液體，並用濾紙小心地吸乾載玻片上樣本周圍的液體。將處理好的樣品放入濕箱中。
2. 陽性對照的 DNase 處理步驟
樣品滲透後， 用 DNase I 處理細胞以製備陽性對照玻片。這個過程通常會導致大多數細胞 經過處理後呈現綠色螢光。
[註]：Dnase I處理固定化細胞會導致染色體DNA斷裂，產生許多可標記的DNA 3'端。
2.1.以去離子水以1:10的比例稀釋10×DNase I Buffer（每個樣本需200 μL 1×DNase I Buffer，即20 μL 10×DNase I Buffer和180 μL去離子水稀釋）。將 100 µl 滴加入可滲透樣品中並在室溫下孵育 5 分鐘。將 1 μL DNase I（1U/μL）加入剩餘的 100 μL 1×DNase I 緩衝液中，使終濃度達到 10 U/mL。
2.2.輕輕拍去液體，再加入100μL含10U/mL DNase I的緩衝液，室溫孵育10分鐘。
2.3.輕拍載玻片以去除多餘的液體，然後用去離子水在染槽中徹底清洗載玻片3-4次。
[注意]：陽性對照玻片必須使用單獨的染色槽，否則陽性對照玻片上殘留的 DNase I 可能會在實驗玻片上引入高背景。
3. 標記與檢測
3.1.平衡緩衝液（5 x 平衡緩衝液）以去離子水以 1:5 的比例稀釋（每個樣本需要 100 μL 1 x 平衡緩衝液）。
3.2.在每個樣品中加入平衡緩衝液（100 μL 1×平衡緩衝液）以完全平衡區域，並在室溫下孵育 10-30 分鐘。或者，將其滑入含有 1 x 平衡緩衝液的大桶中，以確保載玻片不會平衡樣品。在平衡細胞的同時在冰上解凍 Alexa Fluor 640-12-dUTP 標記混合物，並根據表 1 為所有實驗和可選的陽性對照反應準備足夠的 TdT 孵育緩衝液。對於表面積較大的樣品，試劑體積可以相應增加。

表 1. 為實驗準備的 TdT 孵育緩衝液和可選的陽性對照反應

[陰性對照體系]：配製不含TdT酵素的對照孵育緩衝液，以ddH2O取代TdT酵素。
3.3.用吸水紙洗掉平衡區域周圍的大部分100 μL 1×平衡緩衝液，然後將50 μLTdT 孵育緩衝液加入5 cm2 的細胞區域。不要讓細胞變乾。此後，應將載玻片避光。
3.4.將塑膠蓋玻片放在細胞上以確保試劑分佈均勻，並在濕箱底部放置一塊用水浸濕的紙巾。將載玻片放在濕盒中並在37°C下孵育60分鐘。用鋁箔紙包裹濕盒子以保護其免受光照。
[注意]：使用前可將塑膠蓋玻片切成兩半。折疊蓋玻片的邊緣以便於取出和操作。
3.5.移除塑膠蓋玻片，將切片在 PBS 溶液中室溫孵育 5 分鐘。然後用新鮮 PBS 清洗切片兩次。
3.6.用濾紙輕輕擦拭樣本周圍和背面的 PBS 溶液。
[註]：為了降低背景，用PBS清洗載玻片一次後，可以用含有0.1％Triton X-100和5mg / mL BSA的PBS清洗3次，每次5分鐘，以使遊離的未反應的標記物清晰乾淨。
3.7.將樣本放入染色槽進行染色，將玻片浸入含有PI溶液(1μg/mL，新鮮配製並以PBS稀釋)的染色槽中，避光，室溫放置5分鐘。 （可選）：樣本放入染色槽染色，將玻片在避光條件下浸入含有DAPI溶液（2 μg/mL，新鮮配製並用PBS稀釋）的染色槽中，室溫放置5分鐘。
3.8.清洗樣品，將玻片浸入去離子水中並在室溫下放置 5 分鐘。重複兩次，總共清洗三次。
3.9.將載玻片上多餘的水分敲乾，並在樣本區域加入 100 μl PBS，以保持樣本濕潤。
3.10.樣品立即在螢光顯微鏡下分析，在 620 nm 處檢測到 Alexa Fluor 640 紅色螢光，在 460 nm 處觀察到藍色 DAPI。 DAPI 可以將凋亡細胞和非凋亡細胞染成藍色，並且僅在凋亡細胞核中才摻入 Alexa Fluor 640-12-dUTP 並局部出現紅色螢光。如果有必要，可以將玻片在 4°C 黑​​暗條件下保存過夜。
4. 流式細胞儀檢測懸浮細胞
4.1. 3~5×106個細胞用PBS在4℃離心（300×g）兩次，在4℃以300g離心10分鐘，然後用0.5 mL PBS重懸。
4.2.固定細胞，加入5 mL PBS 製備的1%多聚甲醛溶液，在冰上放置20 分鐘。
4.3.將細胞在4°C下以300×g離心10分鐘，除去上清液並重新懸浮於5mL PBS中。重複清洗一次並以 0.5 mL PBS 重新懸浮細胞。
4.4.細胞透化，加入5mL冰預冷的70％乙醇，-20℃孵育4小時。細胞可於-20℃下保存在70％乙醇中一周，或用PBS製備0.2％Triton X-100溶液透性細胞並於室溫下保存5分鐘。
4.5.將細胞以 300 × g 離心 10 分鐘，然後懸浮在 5 mL PBS 中。重複離心並重新懸浮於 1 mL PBS 中。
4.6.將 2 × 106 個細胞轉移到 1.5 ml 微量離心管中。
4.7.將平衡液以 300 × g 離心 10 分鐘，除去上清液並以 80 μL 1 × 平衡緩衝液重新懸浮。室溫下孵育 5 分鐘。
4.8.在平衡細胞的同時，將 Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix 在冰上融化，並按照表 1 製備足夠量用於所有反應的 TdT 孵育緩衝液。
4.9.將細胞以 300 × g 離心 10 分鐘，除去上清液，將沉澱物重懸於 50 μL TdT 孵育緩衝液中，並在 37℃下孵育 60 分鐘，避光。每 15 分鐘用微量移液管輕輕重新懸浮細胞。
4.10.加入 1 mL 20 mM EDTA 並用微量移液器輕輕混合來終止反應。
4.11.以 300 g 離心 10 分鐘後，棄上清液，將沉澱物重新懸浮在 1 mL 以 PBS 製備的 0.1% Triton X-100 溶液中，並含 5 mg/mL BSA。此溶液重複一次，總共清洗兩次。
4.12.以流式細胞儀分析細胞並測量 620 nm 處的 Alexa Fluor 640 紅色螢光。