指示

1. 實驗前準備

1） 準備好實驗所需的試劑和材料。

2）確認適用性 qPCR 儀器

該試劑盒可在以下類型的qPCR儀器上使用：

1. Bio-Rad：CFX96
2. Thermo Scientific：7500即時PCR系統；QuantStudio™5；
3. 實驗方法

1） DNA萃取

我們建議使用 ‘ 磁性殘留 DNA 樣本製備試劑盒' （目錄號 18461ES 手動提取和 貨號：18462ES 自動提取） DNA萃取， 你 能 訪問 ‘ http://www.yeasenbiotech.com ‘  為了 這

詳細資訊和購買。

此套件（Cat#40619ES）包含內部控制（IC）。如果在 DNA 萃取之前將 IC 添加到樣本中，則可以驗證完整的過程（包括 DNA 萃取和 qPCR 反應）。如果將 IC 加入 qPCR 主混合物中

直接地， IC 僅作為 qPCR 控制。

2）qPCR Mix 製備

1. 根據樣本量，包括陽性對照（PCS）、無模板對照（NTC）、陰性對照  對照溶液（NCS）和測試樣品（TS）來計算反應次數。平行準備 2 反應

一般情況下每個樣本都是這樣的。

* PCS：正極 控制 溶液；NTC：無 範本 對照；NCS：陰性 控制 解決方案；TS：測試 樣本。那裡 是 不 需要 到 執行

這 樣本 萃取 為了 件 和 NTC，但 國家電腦系統公司 和 TS 是 需要。

反應孔（M1）=（1×NCS + （N×TS） ×2

反應孔（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2

反應孔（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. 根據實驗設計和下表，在冰上預解凍所需量的試劑。
2. 根據反應次數計算 qPCR Mix 的量。請注意，如果該試劑盒將用於產品發布等GMP活動，我們建議使用表1和表2進行製備；如果 該套件將 只是 用於研究，且在評估後提取前無需添加IC，則按照表3進行

準備。請注意，並非所有 M1、M2 和 M3 是 需要 是 準備。

表 1 M1 的 qPCR Mix 體系

*這 配置 系統 在 桌子 1 是 基於 在 這 前提 那 我知道了 是 額外 前 萃取 為了 兩個都 國家電腦系統公司 和 TS，所以 它 是 不是 必要的

到 添加 我知道了 什麼時候 定量PCR 混合 準備。我知道了 添加 方法 前 萃取： 首先，稀釋 我知道了 經過 20次 和 脫氧核糖核酸 稀釋劑，以及 添加 1微升

稀 我知道了 進入 每個 100μL 測試 樣本 為了 這 更遠 萃取。

**這 成套工具 做 不是 包含 氧化還原酶 參考 染料。 如果 氧化還原酶 參考 染料 是 需要 為了 這 真實的 時間 聚合酶連鎖反應 擴大機 那 你 是 現在 使用， 50×ROX 參考 染料 （貨號：10200ES）是 受到推崇的 為了 使用。 在 這 案件 額外 體積 是 0.8μL， 作為 顯示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化還原酶 產品，請 參考 到 他們的 指示 為了 氧化還原酶 添加。如果 不 氧化還原酶 參考 染料 是 需要， 額外 體積 是 0 μL。

表 2 M2 的 qPCR Mix 體系

*這 配置 系統 在 桌子 2 是 基於 在 這 前提 那 我知道了 是 不是 額外 在 件 和 負溫度係數 (NTC) 前 萃取， 所以 我知道了 需求 到 是 額外 期間 定量PCR 混合 準備。我知道了 添加 方法 後 萃取： 稀 我知道了 經過 100次 和 脫氧核糖核酸 沖淡 和 添加 1微升 稀 我知道了 進入

每個 定量PCR 混合 系統。

**這 成套工具 做 不是 包含 氧化還原酶 參考 染料。 如果 氧化還原酶 參考 染料 是 需要 為了 這 真實的 時間 聚合酶連鎖反應 擴大機 那 你 是 現在 使用， 50×ROX 參考 染料 （貨號：10200ES）是 受到推崇的 為了 使用。 在 這 案件 額外 體積 是 0.8μL， 作為 顯示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化還原酶 產品，請 參考 到 他們的 指示 為了 氧化還原酶 添加。如果 不 氧化還原酶 參考 染料 是 需要， 額外 體積 是 0 μL。

表 3 M3 的 qPCR Mix 體系

*這 配置 系統 在 桌子 3 是 基於 在 這 前提 那 我知道了 是 不是 額外 到 樣品 前 萃取，所以 我知道了 需求 到 是 額外    期間 定量PCR 混合 準備。我知道了 添加 方法 後 萃取： 稀 我知道了 經過 100次 和 脫氧核糖核酸 沖淡 和 添加 1微升 進入 每個 定量PCR 混合

系統。

**這 成套工具 做 不是 包含 氧化還原酶 參考 染料。 如果 氧化還原酶 參考 染料 是 需要 為了 這 真實的 時間 聚合酶連鎖反應 擴大機 那 你 是 現在 使用， 50×ROX 參考 染料 （貨號：10200ES）是 受到推崇的 為了 使用。 在 這 案件 額外 體積 是 0.8μL， 作為 顯示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化還原酶 產品，請 參考 到 他們的 指示 為了 氧化還原酶 添加。如果 不 氧化還原酶 參考 染料 是 需要， 額外 體積 是 0 μL。

3）模板添加

1. 將 qPCR 混合物充分搖晃，低速離心，並從蓋子中收集殘留液體

到底部 管子。

1. 添加 20 μL qPCR Mix 加入到每個反應管/孔中。請注意將相應的 qPCR Mix 添加到每個

樣品管並避免添加錯誤。

1. 將模板加入含有 qPCR Mix 的管子/孔中。模板新增見表4。

桌子 4 個模板 添加

*我們建議使用 DNA 稀釋緩衝液 (40619-E) 作為 NCS 模板進行 DNA 萃取。

**這 全部的 反應 體積 在 每個 管/孔 是 40 μL。

***覆蓋 這 管子 蓋 或者 這 盤子 電影。到 避免 影響 這 螢光 訊號 請閱讀 拿 關心 不是 到 標記 這 管子 蓋 或者 電影

或者 甚至 擦 這 電影 反覆 和 一個 刮刀。

****離心機 這 反應 管子 或者 盤子 簡要地 在 低的 速度 後 範本 添加。 後 充足的 搖晃 和 攪拌，重複 離心機

在 低的 速度 到 收集 這 液體 從 這 蓋 或者 牆 到 這 底部。避免 氣泡 什麼時候 手術。這 基線 將要 是 受到影響 如果 這 混合

是 不是 混合 好吧，那麼 這 步 是 非常 重要的 到 一個 好的 實驗 結果。

4）qPCR程序設置

1. 程式檔案設定

範例（7500 實時 PCR 系統儀器和實時 PCR 軟體 v2.4）：

儀器型號：7500 (96孔板)

實驗類型：定量-標準曲線；

化學：Taqman® 試劑

升溫速度：標準（約 2 小時完成一次運轉）

1. 目標頻道設定

在 「定義 目標 和 樣品” 的 「盤子 設定", 創造 一個 目標 1 頻道 （家庭與家庭用品）， 選擇 法姆 作為 這 報告 螢光基團和 MGB 或 沒有任何 作為淬火 螢光 團體。 創造 一個 目標 2 頻道 （維多利亞州）， 選擇 這 報告 螢光 團體 作為 維多利亞州 和 這 淬火 螢光 團體 作為 沒有任何。 在 「分配 目標 和 樣品” 的 「盤子 設定", 如果 不 額外的 氧化還原酶 染料 是 已添加，選擇 “沒有任何”; 如果 額外的 氧化還原酶 是 已添加，選擇

韓氏。

1. 標準擴增程序設定

表5 標準擴增程序設置

1. 基線和閾值設定：

原則 的 基線 調整： 使用 這 自動的 基線 一般來說。 如果 需要 到 調整 在 手動的， 選擇 這 循環 在指數成長之前 週期作為起始週期，避開波動區 最初的 螢光 收藏。選擇最早出現指數擴增的樣本Ct值前1-2個循環作為

終點。

原則 的 臨界點 調整：一般採用自動閾值。如需手動調整，閾值 應該 是 放 更高 比 這 消極的 樣本 或者 這 基線 噪音， 它是 一般來說 放 門檻 在 這 晚的

階段 每個隧道需要指數放大、相對獨立、適當的閾值。

5） 結果 分析

1. PCS、NTC、NCS的結果判斷：

若添加IC：每個控製樣品的規格應為 滿足表6：

桌子 6 結果 判斷 的 封裝, 負溫度係數 和 國家電腦系統公司

若未添加IC:每個品管樣品均應符合表6中FAM訊號欄的規定,且

需要分析 VIC 通道。

1. TS結果判斷

先決條件： 它 是 是否需要確定 件， NTC 和 國家電腦系統公司 通過了規範 在表格中 6 TS 之前 結果分析。 如果通過，則可以 繼續 下一步。 如果不 已通過， 這 TS 結果 可能 不是 是 可靠的， 和

需要調查原因。

如果新增IC：找到相應結果 根據FAM的結果資訊進行判斷，並 維多利亞州 表7中：

桌子 7：結果 判斷 的 TS （我知道了 額外）

*如果 那裡 是 抑制 為了 維多利亞州 信號、治療 是 需要 到 排除 這 抑制劑 或者 重複 這 測試。

若未新增IC：尋找對應結果 根據判斷 FAM結果資訊見表8 ，並且不需要分析 VIC 訊號。

桌子 8：結果 判斷 的 TS （我知道了 不是 額外）

筆記

1. 在使用該套件之前，請仔細閱讀本手冊。實驗應以標準化的方式進行，包括樣品的處理、反應體系的製備和樣品的添加。

2. 盡可能在冰上進行樣品添加和試劑製備作業。
3. 使用前，請將每種試劑旋渦並混勻。

4. 請穿戴工作服和一次性手套進行操作， 您的安全。
5. 本產品僅供研究使用。