維羅 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒用於各類生物製品中間樣本、半成品及成品中Vero宿主細胞DNA殘留量的定量分析。

本試劑盒採用Taqman螢光探針及聚合酶鍊式反應（PCR）方法，具有fg級最低檢測限，可特異且快速地檢測出殘留的Vero細胞DNA。此試劑盒需與殘留DNA樣本製備試劑盒（Cat#18461ES）一起使用。

產品 成分

^*IC：內部控制

運輸和儲存

1. 使用乾冰運輸 並儲存於-20°C 2 人份 年

2. 收到貨後，請立即檢查並存放於相應的儲存溫度。

注意事項

1. 使用該試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規範化，包括樣品處理、反應體系製備及樣品的添加。

2. 最好在冰上添加樣品和製備溶液。

3. 確保每個組分在使用前都充分渦旋並以低速離心。

4. 為了您的安全和健康，操作時請穿著工作服和戴上一次性手套。

5. 本產品僅供研究使用！

適用儀器型號

包括但不限於：

Bio-Rad： CFX96光學模組。

熱電科技： ABI 7500； ABI Quant Studio 5； ABI 步驟 OnePlus。

使用說明

1. 維羅 DNA標準稀釋及標準曲線製作

維羅 使用試劑盒中提供的 DNA 稀釋緩衝液對 DNA 對照組進行梯度稀釋， 稀釋濃度分別為300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 平均每克

請參閱下面的詳細說明：

1.1 解凍 維羅 DNA 對照和 DNA 稀釋緩衝液置於冰上。 完全解凍後，輕輕渦旋混勻，以低速離心 10 秒。

1.2 取出六個 乾淨的1.5 mL試管，標示3 ng/μL、①、②、③、④、⑤、⑥。

1.3 加入90 μL DNA稀釋緩衝液和10 μL Vero DNA 控制 到 1.5 mL 微量離心管，標示為 3 ng/μL，稀釋至 3 納克/μL。混合後離心 10 秒鐘。將稀釋的DNA標準品分裝後，可在-80℃短期保存（不超過3個月），請避免反覆凍融。

1.4 將 90 μL DNA 稀釋緩衝液加入其他 管，然後按照以下步驟進行連續稀釋。

[筆記]：

1. 每個濃度需要三個重複孔。檢測範圍為 3 微克/微升～300皮克/微升 和 如果需要的話，可以擴大該範圍。

2. 為了減少重複凍融的次數，避免污染，建議將 DNA 對照組儲存在 首次在-80°C 下分裝。

3. 解凍後，DNA稀釋緩衝液可以 儲存於2-8°C 保存期限為7天，如長期不使用，請存放於-20°C。

4. 確保模板完全混合，輕輕搖晃混合物 15 秒至 1 分鐘 對於每個梯度稀釋。

2. 提取回收控制 (ERC) 準備

設定濃度 維羅 ERC 中的 DNA 根據需要（ERC 樣本 （以3 pg/μL DNA為例）製備如下：

2.1 將100 μL測試樣本加入乾淨的1.5 mL管中，然後加入10 μL 3pg/μL Vero DNA Standard（③），混勻，標記為ERC。

2.2 進行 ERC 樣本的 DNA 萃取 與測試樣品一起製備純化的 ERC 樣本。

3. 陽性對照樣本 (PCS) 製備（可選）

設定濃度 維羅 PCS 中的 DNA 根據需要（PCS （以3 pg/μL DNA為例）製備如下：

3.1 加入100 μL 3 pg/μL Vero DNA標準品(③) 放入乾淨的1.5 mL 管中，然後標記為 PCS。

3.2 進行 PCS 的 DNA 萃取 與測試樣品一起製備純化的PCS。

4. 消極的 對照溶液 (NCS) 製備

實驗中設定陰性對照，具體操作步驟如下：

4.1 加入 100 μL 將樣本基質（或DNA稀釋緩衝液）倒入乾淨的1.5 mL管中，然後標記為NCS。

4.2 將NCS樣本與檢測樣本同時進行DNA萃取，製備純化的NCS樣本。

5. 無模板對照 (NTC) 製備

設定無模板 實驗中控制，具體操作步驟如下：

5.1 NTC無需樣本預處理，可配置在qPCR檢測殘留DNA含量的階段。

5.2 每管或每孔中NTC樣品20 微升 混合（即 16 微升 Vero qPCR 混合物 + 4 μL Vero 引子和探針混合物）+ 20 μL DNA 稀釋緩衝液。建議配置三個重複孔。

6. PCR反應體系

[筆記]：

1. 根據反應次數計算PCR反應總體積：qPCR Mix =（反應次數+2）×（16+4）μL（包含兩個反應孔的損失）。建議實驗中每個樣品重複三次以上。

2. 蓋上管蓋或封上板後，將反應管或板以低速離心 10 秒鐘。充分搖晃和混合 5 秒鐘後，重複離心，以收集從蓋子或壁到底部的液體。操作過程中避免產生氣泡。

請參閱下表以了解建議的板材設定：

板塊佈局包括：1 NTC（無 範本 對照）1 國家電腦系統公司 （陰性對照 解決方案）， 6 STD（6 個 標準濃度），3 TS（測試樣本），3 ERC（萃取回收對照），1 PCS（陽性對照樣本）。每個樣品設三個重複孔。

7. PCR 儀器設定指南 （兩步法）

以下說明僅適用於 Thermo ABI 7500 qPCR 儀器 （軟體版本2.0）。如果您使用不同的儀器，請參閱適用的儀器指南以取得設定指南。

7.1 建立新實驗，選擇絕對定量或使用者自訂的範本。

7.2 在“Define”介面的“Targets”窗格中，新增一個目標並命名為FAM，選擇報告基因為“FAM”，猝滅劑為“none”。

7.3 在‘Samples’窗格中，依序加入所有樣本的資訊。然後選擇孔，相應地選擇目標和樣本。設定Vero的任務 DNA標準為標準，並賦值300000、30000、3000、300、30、3 （每孔DNA濃度單位為fg/μL）在Quantity欄中填寫，並將各孔命名為STD 1、STD 2、STD 3、STD 4、STD 5、 相應地，STD 6。設定NTC的任務為NTC。設定NCS、TS、ERC 和 PCS 為未知，並根據上面的板塊佈局進行相應命名。然後點擊下一步。

7.4設定擴增程序：設定反應體積為40 μL。

8. qPCR 結果分析

8.1 在分析的擴增圖面板中，系統會自動給出閾值。有時系統給出的Threshold太接近基線，導致重複孔之間的Ct差異很大。您可以手動調整閾值到合適的位置，然後按一下分析。然後可以在Multicomponent Plot中初步檢查擴增曲線是否正常。

8.2 在結果分析標籤中，查看標準曲線圖。驗證斜率、Y 截距、R2 的值 和效率。對於正常標準曲線，R²>0.99； 90%≤有效率%≤110%。

8.3 在 '查看井表' 在分析窗格中，每個樣本的濃度以「定量」顯示，單位為fg/μL，可轉換為pg/μL 或檢測報告中的 pg/mL。

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